鲍鱼脏器β—葡萄糖苷酶提取工艺的优化

2016-05-30 10:48罗小娟杨娟陈锦权方婷陈小艺
安徽农学通报 2016年18期
关键词:提取超声波

罗小娟 杨娟 陈锦权 方婷 陈小艺

摘 要:该研究以鲍鱼脏器为原料,通过冷提取工艺单因素试验,探讨了缓冲液种类、缓冲液pH、料液比、浸提时间对鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶活力的影响,并通过正交试验确定提取的最佳工艺。在此基础上,采用超声波辅助提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液,确定超声辅助提取的最佳工艺条件。结果表明:料液比、缓冲液pH对提取具有显著性的影响(P<0.05),而浸提时间、缓冲液种类对提取的影响不显著。通过比较超声波辅助提取前后β-葡萄糖苷酶活力的大小,可以看出,超声波处理有利于鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取,最佳提取工艺条件为:缓冲液为0.1mol/L pH3.5乙酸-乙酸钠,料液比1∶4,浸提时间4h,超声时间20min,超声功率200W。

关键词:鲍鱼内脏;β-葡萄糖苷酶;超声波;提取

中图分类号 TQ281 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2016)18-0016-05

Extraction Technology Optimization of β-glucosidase from Abalone Viscera

Luo Xiaojuan1 et al.

(1College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Abalone viscera was used as raw materials,through single-factor experiments of cold extraction process,the main influence factors on β-glucosidase activity from abalone viscera such as buffer types,pH value of buffer solution,solid-liquid ratio and extraction time had been investigated. The optimum conditions were obtained by orthogonal test. Based on that,the ultrasound-assisted method was applied to extract crude β-glucosidase from abalone viscera and optimize the extractive conditions. The experimental results showed solid-liquid ratio and pH value of buffer solution had a significant effect on the extraction(P<0.05),but extraction time and buffer types had no significant effect on the extraction. By comparing the change of β-glucosidase activity of the samples which were treated by the ultrasonic treatment before and after,we found that ultrasonic treatment was conducive to extraction of the abalone viscera crude β-glucosidase. The optimum technology conditions were determined as follows:buffer was 0.1mol/L pH 3.5 acetic acid-sodium acetate,solid-liquid ratio was 1∶4,extraction time was 4h,ultrasonic time was 20min,ultrasonic power was 200W.

Key words:Abalone viscera;β-glucosidase;Ultrasonic;Extraction

鲍鱼(Abalone)是一种原始的海洋单壳软体贝类,属软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍螺科(Haliotidae)、鲍属[1]。鲍鱼作为名贵的海产品,兼具高营养价值与药用价值[2-3]。鲍鱼脏器约占鲍鱼软组织总重量的1/3,含有丰富的生物活性物质。近年来,相关研究表明鲍鱼脏器多糖含量丰富,具有抗氧化及免疫调节活性[4-5]。同时,已有报道鲍鱼内脏中含有多种酶类,Go'mez-Pinchett等研究表明,鲍鱼内脏中含有纤维素酶、琼脂水解酶和藻酸酶等消化酶[6-7],宫国君等从鲍鱼内脏中提取出β-1,3-葡聚糖酶粗酶并进行了酶学性质研究[8],E.Serviere-Zaragoza对鲍鱼内脏中不同组织的消化酶的酶学性质进行了研究[9]。然而,国内外尚未有关于鲍鱼内脏β-葡萄糖苷酶的研究。β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶,能催化水解结合于末端芳基或羟基与糖基原子团之间的非还原性β-D-葡萄糖苷键,生成配基和葡萄糖,可应用于降解纤维素,在生产上具有广泛的应用[10-11]。为提高鲍鱼内脏的利用价值,本研究以皱纹盘鲍内脏为原料,采用常规方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液,探讨最佳提取工艺,为该酶的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 (1)材料:皱纹盘鲍内脏:漳州欧圣食品有限公司提供;(2)试剂:对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)购于北京索莱宝科技有限公司;对硝基苯酚,碳酸钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,柠檬酸,柠檬酸三钠,乙酸钠,乙酸,氢氧化钠均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备 JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);PH SJ-3F pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);FA1004A电子天平(上海精天电子仪器有限公司);HWS-28电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);UV-6300PC紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);QL-866旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);冰箱(西门子公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液的冷提取 先把冷冻的皱纹鲍鱼内脏解冻,用手术剪去除其尾部的结缔组织,称重,按一定比例(w/v)加入4℃预冷的一定pH缓冲液,用搅拌机间断打浆2min,放置于4℃冰箱中浸提一定时间后,用高速冷冻离心机离心(9 000r/min,4℃,30min),取上清液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液的超声波辅助提取 先把冷冻的皱纹鲍鱼内脏解冻,用手术剪去除其尾部的结缔组织,称重,按一定比例(w/v)加入4℃预冷的一定pH缓冲液,用搅拌机间断打浆2min后,放入超声波细胞粉碎机中,同时采用冰浴冷却,一次超声时间5s,间歇时间10s,处理一段时间后取出,放置于4℃冰箱中浸提一定时间后,用高速冷冻离心机离心(9 000r/min,4℃,30min),取上清液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的单因素试验 以β-葡萄糖苷酶活力为指标,考察缓冲液种类、缓冲液pH、料液比、浸提时间对鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶冷提取的影响。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的正交试验 在单因素实验的基础上,选取影响实验的3个主要因素:缓冲液pH、料液比、浸提时间作为考察因素,在各因素最佳值附近分别取3个水平,采用L9(34)正交试验表进行设计,做3因素3水平正交试验,以确定β-葡萄糖苷酶冷提取的最佳工艺,并进行验证性实验。正交试验设计因素水平见表1。

1.3.5 超声波辅助提取β-葡萄糖苷酶的单因素试验 从超声波处理对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力影响的角度出发,采用β-葡萄糖苷酶冷提取的单因素试验和正交试验所得的最佳提取条件,分别就影响超声波处理效果的两个主要因素:超声处理时间、超声功率,对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力进行考察。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力测定方法 β-葡萄糖苷酶活力的测定:p-NPG比色法,以400nm处的吸光值来表示β-葡萄糖苷酶活力的大小[]。计算公式如下:

[酶活力(U)=Y×V2×V×NK×V1×T]

式中:Y为酶促反应的吸光度;V1为反应体系中酶液体积(mL);V2为总反应液体积(mL);V为酶液的提取体积(mL);K为对硝基苯酚标准曲线的斜率;T为反应时间(min);N为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线 对硝基苯酚标准曲线如图1,回归方程为y=18.944x+0.0169,R2=0.999 6,斜率K=18.944。

2.2 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的单因素试验

2.2.1 缓冲液种类对酶活的影响 在浸提时间为7h,料液比为1∶2(w/v)的条件下,测定浓度均为0.1mol/L,pH值为3.5的不同种类的缓冲液对β-葡萄糖苷酶活力的影响如图2。由图2可知,缓冲液的种类对鲍鱼脏器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活的影响较明显,用0.1mol/L pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液浸提,所提取的上清液中β-葡萄糖苷酶的酶活性最高,故选用乙酸-乙酸钠缓冲液最为合适。

2.2.2 缓冲液pH对酶活的影响 在浸提时间为7h,缓冲溶液为0.1mol/L乙酸-乙酸钠,料液比为1∶2(w/v)的条件下,分别测定不同pH值浸提下粗酶液中β-葡萄糖苷酶活力,见图3。由图3可知,缓冲液的pH对鲍鱼脏器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活具有显著的影响。0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液在pH3.0~6.0范围内,随着pH值的增大,所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力呈现出先增大后减小的趋势;当0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液pH为3.5时,提取粗酶液的酶活力达到最大值。故应选择pH值为3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液作为鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的提取液。

2.2.3 料液比对酶活的影响 在浸提时间为7h条件下,选择pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液与鲍鱼脏器分别按料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5混合,测定粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力,其结果见图4。由图4可知,所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随着料液比的增加而增大,当料液比为1∶4时酶活力达到最大值;但在料液比达到1∶4后出现明显的下降。故提取的料液比应为1∶4比较适宜。

2.2.4 浸提时间对酶活的影响 在缓冲溶液为pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠,料液比为1∶4(w/v)的条件下,分别测定浸提时间为1、3、5、7、9h下粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力大小,其结果见图5。由图5可知,所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随着浸提时间的延长,呈现出先增大后减小的趋势。在浸提时间为5h时,酶活力接近最大值。因此,最佳浸提时间在5h左右比较适宜。

2.3 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液冷提取工艺的优化 正交试验结果见表2,方差分析结果见表3。

根据极差R值的大小,可得到影响所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的因素主次顺序为:料液比>缓冲液pH>浸提时间。

由表2的极差分析和表3的方差分析结果可以看出,在筛选鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液提取工艺条件的过程中,影响所提β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的因素按关键性依次为B>A>C,即料液比>缓冲液pH>浸提时间。其中,料液比、缓冲液pH对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取具有显著性的影响(P<0.05),而浸提时间对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取的影响不显著。

综合分析图6和表3,可以得到提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液最佳工艺条件为:A2 B2 C3,即缓冲液pH3.5,料液比1∶4,浸提时间4h。

2.4 验证试验结果 由表4可知,采用最佳工艺条件提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力可达到140.58 U,与正交试验表中最高基本一致。因此,通过实验验证,正交试验的结果正确。

2.5 超声波辅助提取单因素试验 在上述试验基础上,考察在超声辅助提取过程中,超声处理时间、超声功率对粗酶液的酶活力的影响。

2.5.1 超声处理时间对酶活的影响 在固定超声功率为200W时,考察不同超声处理时间对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影响,结果如图7所示。由图7可知,当处理时间小于20min时,所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随时间的增加而增大;当处理时间大于20min时,粗酶液的酶活力随时间的增大而下降。此结果出现的原因可能是由于超声处理时间短(小于20min),不足以破碎细胞,释放细胞内的β-葡萄糖苷酶;而长时间的超声波振荡容易引起温度的剧烈上升,导致局部过热,β-葡萄糖苷酶的高级结构遭到破坏,使部分酶变性失活。故选定超声处理时间为20min时,酶活力最高。

2.5.2 超声功率对酶活的影响 在固定超声时间为20min时,考察不同超声功率对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影响,结果如图8所示。由图8可知,超声波的输出功率对细胞破碎效果具有显著的影响。当超声功率小于200W时,随超声功率的增加,所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力逐渐增大;当超声功率在200~600W范围内,粗酶液的酶活力随功率的增大而下降。该结果产生的原因可能是由于超声功率较小(小于200W),超声功率的增大,有利于液体中空穴的形成,产生更多的空化泡,使细胞破碎作用增强;而超声功率过大导致局部过热,使部分酶变性失活。故超声功率采用200W较为适宜。

2.6 两种提取方法的比较 冷提取的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力为140.58U,超声波辅助提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力为174.71U,酶活力提高34.13U。由此可见,超声波处理得到的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力更高,超声波辅助方法更有利于鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶的提取。

3 结论

用新鲜的皱纹盘鲍脏器为原料,通过冷提取工艺的单因素试验和正交试验、超声波辅助提取工艺的单因素试验,最后确定了一整套冷提取方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的工艺。冷提取方法各因素对酶活影响:料液比、缓冲液pH对提取具有显著性的影响(P<0.05),而浸提时间、缓冲液种类对提取的影响不显著。通过比较冷提取与超声波辅助提取方法,可以看出,超声波处理有利于鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取,其最佳提取工艺条件为:缓冲液为pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠,料液比1∶4,浸提时间4h,超声时间20min,超声功率200W。研究结果为鲍鱼脏器酶的开发利用提供了一定的试验依据。

参考文献

[1]Nicole Kresge,Victor D.Vacquier,C.David Stout.Abalone lysine:the dissolving and evolving sperm protein[J].BioEssays,2001,23(1):95-103.

[2]Kyung-A Lee,Eun-Su Shin.Quality Characteristics of Abalone PorridgeWith Viscera[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition,2008,37:103-108.

[3]Jae-Young Je,Soo Yeon Park,Joung-Youl Hwang et al. Amino acid composition and in vitro antioxidant and cytoprotective activity of abalone viscera hydrolysate[J].Journal of Functional Foods,2015,16:94-103.

[4]Bei-Wei Zhu,Li-ShaWang.Antioxidant activity of sulphated polysaccharide conjugates from abalone(Haliotis discus hannai Ino)[J].European Food Research and Technology,2008,227:663-668.

[5]Zhu Bei-Wei,Zhou DL et al.Chemical composition and free radical scavenging activities of a sulphated polysaccharide extracted from abalone gonad(Haliotis Discus Hannai Ino)[J].Food Chemistry,2010,121:712–718.

[6]Da-Yong Zhou,Bei-Wei Zhu,Lu Qiao,et al. In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone(Haliotis discus hannai Ino)viscera[J].Food and Bioproducts Processing,2012,90(2):148-154.

[7]J.L.Go'mez-Pinchetti,G.Garc'?a-Reina.Enzymes from marine phycophages that degrade cellWalls of seaweeds[J].Mar.Biol.,1993(116):553-558.

[8]宫国君,朱蓓薇,杨静峰,等.皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究[J].食品工业科技,2012(3):110-113.

[9]E.Serviere-Zaragoza,M.A.Navarrete de1 Toro. Protein-hydrolyzing enzymes in the digestive systems of the adult Mexican blue abalone,Haliotis fulgens(Gastropoda)[J].Aquaculture,1997,157:325-336.

[10]Gefen G,Anbar M,Morag E,et al.Enhanced cellulose degradation by targeted integration of a cohesin-fused 13-glucosidase into the clostridi-um thermocellum cellulosome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(26):10298-10303.

[11]Stefanakis D,Margellou A,Psarouli A,et al.Immobilization of glucose oxidase and 2-hydroxybiphenyl 3-monooxygenase in mesoporous sili-ca:characterization studies and construction of an amperometric glu- cose biosensor[J].Anal Lett.,2010,43(16):2582-2597.

[12]张亮,王清章,李泱,等.莲子β-葡萄糖苷酶提取及酶学性质研究[J].食品科技,2008(6):142-146.

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