淫羊藿苷对SAMP8小鼠肝脏、肾脏及胸腺的保护作用

陈发菊，金　凤，吴　芹，石京山

(遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

淫羊藿苷对SAMP8小鼠肝脏、肾脏及胸腺的保护作用

陈发菊，金凤，吴芹，石京山

(遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察淫羊藿苷(Icariin，ICA)对快速衰老小鼠(SAMP8)的肝脏、肾脏及胸腺的保护作用，并探索其可能机制。方法 随机选取SAMR1 小鼠作为对照组，雄性SAMP8小鼠随机分为4组(每组12只)，SAMP8模型组及ICA(20、40、80 mg/kg)灌胃给药组，每天1次，连续3个月；SAMP8组和SAMR1组小鼠灌胃等体积的双蒸水，直至8月龄处死，取肝脏、肾脏及胸腺。β-半乳糖苷酶染色法对肝脏和肾脏进行染色；生化法检测肝脏、肾脏及胸腺匀浆上清液中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。结果 与SAMR1组相比，肝脏和肾脏的β-半乳糖苷酶染色发现SAMP8的蓝色颗粒较多；肝脏、肾脏及胸腺匀浆上清液中，SAMP8的MDA含量增多，而SOD和GSH-Px的活性减弱；与SAMP8组相比，ICA给药组β-半乳糖苷酶染色蓝色颗粒减少；MDA的含量减少，而SOD和GSH-Px的活性增加。结论 ICA具有保护肝脏、肾脏及胸腺的作用，其可能的机制与体内β-半乳糖苷酶、SOD、GSH-Px及脂质过氧化物有关。

[关键词]淫羊藿苷；β-半乳糖苷酶；丙二醛；谷胱甘肽过氧化物酶

衰老是自然界不可抗拒的自发过程，它是复杂的自然现象，表现为机构和机能衰退，适应性和抵抗力减退。快速衰老小鼠(SAMP8)是一种异常的衰老模型，主要以快速衰老为主要特征，SAMP8小鼠在衰老过程中与老龄化的人类有着相似特征[1]。在衰老过程中，氧化应激起着非常重要的作用，氧自由基对神经细胞凋亡、神经突触传导等方面均有明显损伤，因此抗氧化应激也是延缓组织器官衰老的重要手段[2]。

淫羊藿(epimedium)是小檗科植物，ICA是主要有效成分，现代药理学研究表明，ICA研究范围主要集中在对骨系统、免疫调节和延缓衰老、生殖系统、心血管系统等方面[3]。我室前期研究表明，ICA能改善Tg2576小鼠空间学习记忆功能[4]，ICA对自然衰老大鼠在一定程度上具有抗衰老作用并可以改善衰老小鼠的学习记忆功能[5-6]。ICA可长期使用，安全性高，有望走向人类抗衰老的临床使用[7]。本实验旨在观察SAMP8在衰老过程中肝脏、肾脏及胸腺中β-半乳糖苷酶、SOD、GSH-Px及脂质过氧化物的变化及ICA给药后对这些酶的保护作用。

1材料与方法

1.1仪器光学显微镜(德国Leica公司)，电热鼓风干燥机(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，酶标仪(北京平利洋医疗设备有限公司)，恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)。

1.2动物快速衰老小鼠(SAMP8)及对照小鼠SAMR1由北京大学医学部提供。

1.3试剂淫羊藿苷购于南京泽朗医药技术有限公司，经HPLC测定纯度≥98%；SOD、MDA及GSH-PX购于南京建成生物工程研究所；冰冻切片组织衰老特异性β-半乳糖苷酶购于上海杰美基因医药科技有限公司。

1.4分组及给药随机选取SAMR1 小鼠作为对照组，雄性SAMP8小鼠随机分为4组(每组12只)，SAMP8模型组及ICA(20、40、80 mg/kg)灌胃给药组(分别记为ICA20、ICA40和ICA80)，每天1次，连续3个月；SAMP8组和SAMR1组小鼠灌胃等体积的双蒸水，直至8月龄处死，取肝脏、肾脏及胸腺。

1.5β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)小鼠颈椎脱臼处死，4%多聚甲醛透心灌注并固定24 h，30%蔗糖水进行脱水24 h，然后用冰冻切片机取肝脏和肾脏冰冻切片，厚度5 μm，取20～25张，根据衰老相关β-半乳糖苷酶试剂盒进行染色，在光学显微镜下观察和计数。

1.6肝脏、肾脏及胸腺中MDA含量、SOD及GSH-PX活性的测定给药结束后，小鼠脱臼处死，取肝脏、肾脏及胸腺组织，准确称取肝脏、肾脏及胸腺的组织重量，按照重量(g):体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积生理盐水，剪碎组织，冰浴制备匀浆，2 500～3 000 rpm/min，离心10 min，取上清液放-80 ℃冰箱备用。

2结果

2.1ICA对β-半乳糖苷酶的影响在肝脏中，SAMR1与SAMP8相比，SAMR1的阳性颗粒散在分布于细胞质中，而在SAMP8组中阳性颗粒增多(P<0.05)。在肾脏中，SAMR1与SAMP8相比，SAMR1的阳性颗粒呈椭圆形分布于细胞质中，而在SAMP8组中阳性颗粒明显增多(P<0.05)。ICA(20、40、80 mg/kg)与SAMP8相比，给药组的阳性颗粒明显减少(P<0.05，见图1和图2)。

A：肝脏β-半乳糖苷酶染色结果(400×)；B：β-半乳糖苷酶阳性细胞数量化统计分析结果与SAMR1组相比，P<0.05；#:与SAMP8组相比，P<0.05。　　图1　ICA对SAMP8小鼠肝脏的β-半乳糖苷酶的影响

2.2ICA对肝脏、肾脏及胸腺中MDA含量、SOD及GSH-PX活性的影响SAMR1与SAMP8相比，

在肝脏、肾脏和胸腺中MDA的含量明显增加，SOD及GSH-PX的活性明显降低(P<0.05)。ICA(20、40、80 mg/kg)给药组与SAMP8组相比，在肝脏、肾脏及胸腺中MDA的含量明显降低，SOD及GSH-PX的活性明显增加(P<0.05，见表1、表2和表3)。

组别MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR163.21±1.48498.2±8.43532±182SAMP875.03±1.56*457.4±7.2*1239±581*ICA2066.15±1.78#496.8±12.4#2916±511#ICA4059.78±0.74#541.2±12.1#3938±116#ICA8046.15±0.71#605.8±4.1#4457±346#

*:与SAMR1组相比，P<0.05；#:与SAMP8组相比，P<0.05。

A：肾脏β-半乳糖苷酶染色结果(400×)；B：β-半乳糖苷酶阳性细胞数量化统计分析结果与SAMR1组相比，P<0.05；#：与SAMP8组相比，P<0.05。图2　ICA对SAMP8小鼠肾脏的β-半乳糖苷酶的影响

组别MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR1110.10±2.83506.3±10.61448±137SAMP8155.50±4.20*393.3±4.4*1091±86*ICA2085.30±1.98#392.3±1.11418±184#ICA4084.71±1.94#431.8±11.9#1828±192#ICA8067.73±2.60#481.6±21.5#1890±398#

*:与SAMR1组相比，P<0.05；#:与SAMP8组相比，P<0.05。

组别MDA含量[nmol/mg(pro)]SOD活性[U/mg(pro)]GSH-Px活性[U/mg(pro)]SAMR128.72±1.122073±1464441±356SAMP8539.80±14.20*1149±34* 3651±270*ICA2037.91±6.25#1374±48# 4223±887ICA4032.84±3.43#1906±117#4255±357ICA8020.30±1.61#2565±161#5230±838#

*:与SAMR1组相比，P<0.05；#:与SAMP8组相比，P<0.05。

3讨论

本实验采用SAMP8模型小鼠观察了我省道地中药材淫羊藿的主要有效成分之一， ICA对肝脏、肾脏及胸腺防衰老的保护作用。快速老化模型小鼠SAM，由竹田教授于1968年引进日本，根据老化速度分为正常老化的R品系(Senile-Resistant)和快速老化的P品系(Senile-Prone)[8]。有文献报道SAMP8小鼠在3月龄时就开始迅速衰老，且与人类衰老有相似的特征，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型[9-10]。β-半乳糖苷酶染色是β-半乳糖苷酶在酸性条件下稳定表达，催化生成蓝色的沉淀产物，在光学显微镜下观察到蓝色表达的组织细胞，可视为组织细胞复制性衰老的分子特征。β-半乳糖苷酶染色法用于鉴定细胞衰老程度，蓝色颗粒数的多少反映组织衰老的程度[11]。本实验结果显示ICA减少了肝脏和肾脏的蓝色颗粒数表达，提示ICA可能对肝脏和肾脏具有防衰老的保护作用。

许多临床研究已经报道了氧化应激参与衰老的过程[12]，自由基是脂质过氧化，促进衰老的重要因子。内源性抗氧化物酶SOD和GSH-Px能清除体内自由基。MDA是一个通过自由基诱导的重要脂质过氧化的产物，被用作氧化应激的生物学标记[13]。MDA能导致细胞膜和中枢神经系统受损，有研究表明在SAMP8小鼠的幼年期脂质过氧化物的水平比SAMR1小鼠显著升高，并认为这可能是导致肝脏、肾脏等器官衰老的原因[14-15]。本实验发现在SAMP8小鼠的肝脏、肾脏和胸腺匀浆上清液中，氧化应激水平比同月龄的SAMR1小鼠明显升高，包括MDA含量增加，GSH-Px和SOD的活力下降。ICA给药后MDA含量减少，GSH-Px和SOD的活性增加，表明ICA具有抗自由基氧化的作用。

综上所述，ICA对肝脏、肾脏和胸腺具有防衰老的保护作用，其机制可能与提高体内抗自由基氧化有关。

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[收稿2016-01-05;修回2016-03-09]

(编辑：王静)

Protection of Icariin on liver, kidney and thymus in SAMP8 mice

ChenFaju,JinFeng,WuQin,ShiJingshan

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the protection of Icariin (ICA) on of liver, kidney and thymus in senescence accelerated mouse prone 8 (SAMP8) mice and further explore the possible underlying mechanisms.Methods SAMP8 mice were randomly divided into model group, ICA low-, middle- and high-dose of ICA groups. whereas SAMR1 mice selected as control group. Low-, middle- and high-dose of ICA group were administered with ICA at doses of 20, 40 and 80 mg/kg for consecutive 3 months. Control and model groups were administered with double-distilled water. Then, mice were sacrificed and liver, kidney and thymus were collected. β-galactosidase staining were performed to observe the number of aging cells in the liver and kidney. Moreover, the biochemical method was used to detect the content of malondialdehyde (MDA) and the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) in the liver, kidney and thymus homo genates.Results Compared with the control group, the mean number of blue particles and the content of MDA were significantly increased in the liver and kidney and the activities of GSH-Px and SOD were dramaticlly decreased in liver, kidney and thymus homogenates of model group. However, the mean number of blue particles and the content of MDA significantly were decreased, and the activities of GSH-Px and SOD were markedly increased in liver, kidney and thymus homogenates of ICA treatment group.Conclusion ICA could protect liver, kidney and thymus in SAMP8 mice, and the possible mechanisms might be related to the activity of SA-β-gal, SOD, GSH-Px and lipid peroxide.

[Key words]Icariin; β-galactosidase; MDA; GSH-Px

[中图法分类号]R964

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)02-0150-04

[通信作者]石京山，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：神经药理，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81160400)。