胚胎着床内膜中半乳凝素-3的表达变化及其在母胎界面与配体的共定位

王　璐　张　炜

(复旦大学附属妇产科医院生殖内分泌科　上海　200011)

胚胎着床内膜中半乳凝素-3的表达变化及其在母胎界面与配体的共定位

王璐张炜△

(复旦大学附属妇产科医院生殖内分泌科上海200011)

【摘要】目的探讨半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)在小鼠胚胎着床子宫内膜中的表达及其与子宫内膜容受性标志分子整合素(integrin) β3的共表达定位。方法分别采用real-time PCR、Western blot和免疫荧光技术检测比较小鼠着床位点及非着床部位gal-3 mRNA和蛋白的表达及其与配体整合素 β3、纤连蛋白(fibronectin,FN)的免疫荧光共定位表达。结果小鼠着床处gal-3 mRNA和蛋白表达高于非着床部位(P<0.01)，其在着床位点主要与整合素β3共定位表达,而与FN的共定位极少。结论gal-3在着床位点处高表达提示其在胚胎与子宫内膜着床的过程中扮演重要角色,且在着床处gal-3主要通过与整合素β3共表达参与胚胎着床。

【关键词】半乳凝素-3;胚胎着床;整合素β3;纤连蛋白

胚胎着床是处于活化状态的胚泡与处于容受态的子宫内膜间相互作用并进入子宫内膜的复杂过程。在着床过程中,包含了相当复杂的形态学、生理学和生物化学的变化,通过胚胎和子宫内膜间的一系列的分子对话和信号转导,最终启动着床。半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)是相对分子质量为29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族的一员。它广泛分布于不同的细胞和组织中,主要通过与配体结合参与细胞的生长、黏附、侵袭、凋亡等过程,其配体包括整合素(integrin)和细胞外基质蛋白如层黏连蛋白、纤连蛋白(fibronectin,FN)等。研究表明gal-3在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等方面发挥着重要的生物学作用[1]。近年来发现该分子与胚胎早期发育和着床过程有关。最早发现人妊娠早、晚期的绒毛滋养细胞及绒毛外滋养细胞的胚胎滋养层中均有gal-3表达。我们前期的研究发现其在人的子宫内膜着床窗口期高表达,并参与调节子宫内膜的生物学功能[2];在子宫内膜异位症患者在位内膜中发现gal-3表达降低。进一步的体外研究发现滋养细胞与子宫内膜细胞的gal-3表达与分泌受雌、孕激素的影响,且细胞内及细胞外的gal-3通过不同整合素配体的作用诱导子宫内膜细胞的增殖、黏附和凋亡行为,从而调节子宫内膜的容受性建立。前期的研究结果都提示gal-3参与胚胎着床,但其在子宫内膜与胚胎界面间有怎样的改变以及作用的分子通路仍需要进一步的研究。

材 料 和 方 法

实验动物及主要试剂SPF级昆明小鼠购于上海实验动物中心;芝加哥天蓝购于美国Sigma公司;总RNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购于北京天根生化科技公司;real-time PCR试剂盒购于大连Takara公司;单克隆小鼠抗gal-3、多克隆兔抗(FN)、HRP二抗及Alexa647羊抗兔二抗购于美国Abcam公司;单克隆大鼠抗gal-3和单克隆美洲仓鼠抗整合素β3购于美国Millipore公司;Alexa555羊抗大鼠二抗购于美国CST公司;FITC羊抗美洲仓鼠二抗购于美国eBioscience公司。

实验动物准备SPF级昆明小鼠,6～8周龄,体质量23～25 g,饲养温度25 ℃,光照周期12/12。按雌雄比例3∶1合笼交配,次晨检查阴栓,发现阴栓为妊娠D1。在D5晨8:00～11:00经小鼠尾静脉注射1% 芝加哥天蓝,5 min后处死小鼠。在无菌条件下分别收集每只孕鼠的胚胎着床位点及非着床位点处组织,着床位点为芝加哥天蓝染色处。而未孕小鼠同样在无菌条件下收集子宫。从每只孕鼠一侧子宫收集的标本迅速于-80 ℃冻存,另一侧的标本经固定和脱水后用OCT包埋,于-80 ℃保存。

real-time PCR检测收集的标本利用Trizol法抽提组织总RNA。RNA提取后用0.01% DEPC水溶解,采用BioTek多孔酶标仪定量,逆转录成cDNA,按照荧光定量PCR方法进行基因的半定量分析。引物序列[3]:gal-3,上游5′-CAGGAAAATGGCAGACAGCTT-3′,下游5′-CCCATGCACCCGGATATC-3′;β-actin,上游5′-AGATTACTGCTCTGGCTCCT-3′,下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反应条件:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,29个循环,末次循环后72 ℃延伸10 min。

Western blot检测将组织在RIPA和PMSF 裂解液中匀浆,冰上孵育30 min后高速离心,取上清即蛋白质溶液,BCA蛋白定量测定蛋白浓度。提取的蛋白质于-80 ℃保存。灌制SDS聚丙烯酰胺:15%分离胶和5%浓缩胶。取样本蛋白50 μg加5×缓冲液混匀,95 ℃变性5 min,上样。梯度蛋白作为分子量对照。浓缩胶电泳运行60 V,当蛋白质进入分离胶后,把电压加到120 V,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部。切除浓缩胶后,将胶在转移缓冲液中平衡15 min,剪取与分离胶大小相同的PVDF膜,用转移缓冲液浸透>10 min。剪6块大小相同的Whatman 3 mm滤纸用转移液浸透。自下而上依次叠放3张滤纸、PVDF膜、凝胶、另外3张滤纸,稳定电流270 mA转移2 h。取出PVDF膜,0.1% PBST洗膜,放入5%封闭液中,室温摇床震荡1 h。将PVDF膜放入孵育盒,加入含单克隆小鼠抗小鼠gal-3(1∶1 000)和β-actin内参(1∶1 000)的封闭液,4 ℃震荡过夜。取出PVDF膜,用PBST洗涤5 min×3次。将膜转入另一孵育盒中,加入封闭液稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶3 000),室温震荡1 h,PBST洗涤20 min×3次。应用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System扫描检测,得出的IOD值经内参β-actin校正后进行统计分析。

免疫荧光检测用切片机将包埋好的组织块切成厚度为4 μm的切片。用PBS洗去切片上OCT,放入盛有0.01 mol/L枸橼酸钠的容器中,98 ℃热修复20 min,室温冷却,PBS洗5 min×3次。滴加10% 羊血清室温封闭30 min。滴加一抗混合液，含有大鼠单克隆gal-3抗体(1∶200)、美洲仓鼠单克隆整合素β3抗体(1∶50)和兔多克隆FN抗体(1∶50)，4 ℃孵育过夜。PBS 洗去一抗, 10 min×3次,滴加二抗混合液，含有Alexa Fluor555羊抗大鼠IgG(1∶500)、FITC羊抗美洲仓鼠IgG(1∶100)和Alexa Fluor 647羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃孵育30 min。PBS洗去二抗,10 min×3次，滴加DAPI及抗荧光淬灭剂。用中性树脂封片,利用Leica TCS SP5 MP共聚焦显微镜观察免疫荧光结果。

统计学处理采用单因素方差分析和LSD法检验两组间均数的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

gal-3 mRNA在小鼠子宫着床位点与非着床位点的表达在小鼠子宫着床位点及非着床位点均可检测到gal-3 mRNA的表达,且其表达明显强于未孕小鼠子宫内膜(t=15.33和6.221,P<0.001)。着床位点gal-3 mRNA表达高于非着床位点,差异有统计学意义(t=8.645,P<0.001,图1)。

(1)vs.Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

图1gal-3 mRNA 在小鼠子宫着床处与

非着床处的表达比较

Fig 1Gal-3 mRNA expressions in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3蛋白在小鼠子宫着床位点与非着床位点的表达在着床位点和非着床位点,早孕小鼠子宫内膜上gal-3蛋白表达均强于未孕小鼠(t=11.029,P<0.001;t=3.878,P<0.05),而gal-3蛋白在着床位点的表达量明显高于非着床位点(t=8.30,P<0.001,图2)。

(1)vs. Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

图2gal-3在小鼠子宫着床处与非着床处的蛋白表达

Fig 2gal-3 expression in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3 及其配体整合素β3、FN在小鼠子宫着床位点的共定位早孕小鼠子宫着床位点及非着床位点处均有gal-3及其配体整合素β3、FN的表达,gal-3及其配体整合素β3主要定位于子宫内膜上皮细胞,而FN则主要定位于间质细胞及胚胎。着床位点gal-3及整合素β3的表达明显强于非着床位点,而FN的荧光强度在着床位点及非着床位点无明显区别(图3)。gal-3及整合素β3的共定位表达结果显示，在着床位点子宫内膜上皮细胞多处可见两者共表达,而整合素β3是gal-3的主要配体,说明两者在着床位点处可能广泛结合(图4A)。但gal-3、整合素β3和FN的共定位结果则提示FN未参与gal-3和整合素β3的结合(图4B)。

讨论

gal-3是一种多功能分子,其主要与细胞表面的糖基化蛋白或细胞外基质糖蛋白结合,包括整合素、细胞外基质分子(extracellular matrix,ECM)、信号分子ras等,gal-3通过与配体结合发挥多种生物学功能,如细胞生长、增殖、黏附、迁移及凋亡等[4-5]。已在多种肿瘤组织中发现gal-3高表达,发现该基因主要参与肿瘤的发展和转移。gal-3通过与相应配体结合促进肿瘤细胞的增长、抑制其凋亡,诱导肿瘤细胞转移。而胚胎着床与肿瘤种植转移在生物学行为方面有高度的相似性,只是前者是有节制的,而后者是失去控制的无限扩张。

gal-3是相对分子质量为29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷结合蛋白。其结构在gal家族中很独特,1条多肽链形成2个不同的结构域:富含甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸残基的重复性胶原样序列和羧基末端的CRD[6-8]。羧基末端的CRD是gal-3作为凝集素家族的标志性结构域,同时也是其发挥凝集素活性与特定配体结合的结构域。gal-3广泛分布于分布于细胞内外,参与调节细胞的生长、黏附、侵袭、凋亡等过程。

我们的前期研究利用抑制性差减杂交技术筛选出一些与子宫内膜容受性建立相关的基因,gal-3是其中之一[9],进一步研究发现其表达在分泌中期子宫内膜达最高峰,且定位于子宫内膜上皮细胞[2],由此我们就gal-3对子宫内膜容受性形成的影响进行了研究,发现gal-3对子宫内膜上皮细胞的增殖、黏附和凋亡具有调节作用。gal-3可影响子宫内膜细胞上整合素β3的表达,利用整合素β3抗体可阻断gal-3对子宫内膜上皮细胞的增殖及黏附的作用,提示gal-3通过整合素β3通路可能激活了细胞增殖和黏附的调控信号,以调节子宫内膜的生长和黏附[10]。子宫内膜异位症患者在位内膜上gal-3表达降低,子宫内膜异位症是引起不孕的原因之一,其中gal-3表达下调可能使子宫内膜容受性建立不全,引起胚胎着床失败[11]，进一步提示该分子与子宫内膜容受性形成密切相关。但gal-3在子宫内膜与胚胎界面间产生了怎样的影响仍需要进一步的研究。因此,我们对gal-3及其配体在着床期母胎界面的表达及定位进行了深入研究。

本研究利用小鼠早期胚胎着床模型,在体研究了gal-3在着床位点和非着床位点的表达变化,首次揭示gal-3 mRNA及蛋白在孕小鼠子宫上表达增加,且着床部位的表达明显高于非着床部位。gal-3可能在着床处内膜的容受性形成过程中扮演重要角色,它可能介导了着床局部子宫内膜与胚胎的黏附和植入。

胚胎着床过程首先由胚胎滋养细胞在子宫内膜上黏附,之后入侵并植入其中,母胎界面上的黏附分子相互作用介导母胎黏附。已证实整合素是与胚胎着床关系最为密切的一类黏附分子,研究发现其中的整合素13、v3、11在“着床窗口期”开放时表达,在“着床窗口期”关闭时消失,因此学者们普遍认为在胚胎和子宫内膜上皮细胞接触早期,是整合素黏附分子和配体相互作用介导了母胎间的黏附,故整合素是调节子宫内膜容受性和胚胎着床的重要分子[12-14]。整合素和ECM都是gal-3的重要配体,同时整合素和ECM又互为配受体,gal-3可以与整合素/ECM单价结合抑制黏附,或双价结合/多价结合形成多聚体复合物增强黏附;也可以改变整合素与ECM的亲和力进而调节黏附;gal-3还可以调节整合素的表达和活性。那么,gal-3在着床位点的高表达是否通过整合素或ECM的分子通路调节母胎界面的黏附、侵袭和植入？为了探索gal-3在母胎界面作用的分子通路,我们观察并比较了着床位点和非着床位点gal-3与配体整合素3、FN的免疫荧光共定位,结果显示:gal-3与整合素3主要表达在着床期的子宫内膜上皮细胞,而FN则主要表达于间质细胞和胚胎上;gal-3与整合素3在着床位点的子宫内膜呈现大量的荧光共定位表达,强度远超出非着床位点,但gal-3与FN的共定位表达无论在着床位点还是非着床位点都很少。gal-3与整合素β3而非FN共同在着床位点处介导母胎间对话,提示gal-3可能与整合素β3共同介导母胎间的黏附,参与内膜容受性的建立。

总之,gal-3在胚胎着床位点高表达提示其在胚胎着床位点处内膜容受性的建立中扮演重要角色,且gal-3及其配体整合素β3在着床位点处介导母胎间黏附。但gal-3与其配体整合素β3结合的具体机制和功能仍需进一步的研究。对gal-3的研究可能为某些原因引起的不孕的治疗提供依据,利用gal-3对着床过程的干扰也可能为计划生育方法的研发提供新的思路。

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The expression change of galectin-3 and co-localization with its ligands in implantation site of endometrium

WANG Lu, ZHANG Wei△

(DepartmentofReproductiveEndocrinology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200011,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of galectin-3 (gal-3) in mouse′s implantation site of endometrium and the co-localization with integrin β3 ,which is the marker molecular molecular for the receptivity of endometrium.MethodsGal-3 mRNA and protein expressions were detected by real-time PCR and Western blot analysis.Immunofluorescence was used to detect the co-locatization of gal-3 and its ligands of integrin β3 and fibronectin(FN).ResultsCompared with inter-implantation site,gal-3 mRNA and protein expressions in mouse implantation site of endometrium were significantly increased (P<0.01).Moreover,the immunofluorescence intensity of the co-localization of integrin β3 and gal-3 was stronger in implantation site than that in inter-implantation site,while the co-localization of FN and gal-3 was very weak.ConclusionsGal-3 expresses highly in implantation site,and co-expresses with integrin β3 at maternal-fetal interface. It indicates that gal-3 plays an important role in the attachment between embryo and endometrium.

【Key words】galectin-3;embryo implantation;integrin β3;fibronectin

【中图分类号】R321.3

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.008

(收稿日期:2015-08-18;编辑:段佳)

教育部博士点基金(20120071110074);上海市优秀学术带头人计划项目(12XD1401200)

△Corresponding authorE-mail:zhangwei623@hotmail.com

*This work was supported by the Ph.D Program Foundation of Ministry of Education,China (20120071110074) and the Program of Subject Chief Scientist of Shanghai (12XD1401200).