高羊茅FaSGR基因RNAi载体构建

文昭竹，尚 丹，龚梨霞，张志飞，2*（湖南农业大学农学院，长沙4028；2湖南农业大学草业科学研究所，长沙4028）



高羊茅FaSGR基因RNAi载体构建

文昭竹1，尚 丹1，龚梨霞1，张志飞1，2*
（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2湖南农业大学草业科学研究所，长沙410128）

摘 要：本实验利用Gateway技术构建了Ubiquitin启动子驱动的高羊茅FaSGR基因的RNAi载体pANDA - B -870，该载体具有潮霉素抗性，适合于单子叶植物遗传转化。通过电击法将pANDA - B -870载体转入到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，验证转化成功。FaSGR基因RNAi载体的构建为进一步探讨FaSGR基因功能及SGR滞绿基因在高羊茅遗传改良中的应用提供了技术支持。

关键词：高羊茅；FaSGR基因；载体构建；RNA干扰；Gateway技术

RNAi（RNA interference）是指一些与靶基因序列同源的小片段干扰RNA，可高效和特异性地使mRNA降解，从而导致内源靶基因的沉默，最终产生相应功能的表型缺失现象［1］。由于RNAi具有特异性、稳定性、高效性和不改变基因组遗传组成性等优点，RNAi技术在研究基因功能方面具有重要作用［2］。高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科羊茅属多年生草本植物，在我国广泛栽培，是目前使用量增长最快的草种，是南方地区绿期最长的冷季型草坪草。高羊茅适应性与抗逆性均较强，但在高温季节有“休眠”甚至枯黄现象。因此，延长绿色期是高羊茅草种选育的主要目标之一。

滞绿（stay green）是指植物在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象，其最显著的特征是植株生育末期叶片保持绿色的时间较长，甚至完全不黄化。滞绿基因SGR大多来源于非功能滞绿突变体，在叶绿素降解过程中调控Psll捕光-叶绿素（LHCⅡ- Chl）复合体的拆卸，是叶绿素分解的启动因素或总开关。滞绿基因的缺失会使植物在衰老过程中叶绿素的降解受到抑制，且能够保持较为完整的叶绿体类囊体膜和叶绿素蛋白复合体结构，但其光合能力随着叶片的衰老而下降［3］。目前滞绿基因的具体作用机制尚不清楚。SGR基因在高等绿色植物中相继被克隆出来，目前在Genebank上登记的有20个单子叶植物的SGR滞绿序列。

目前，尽管在不少植物种属中鉴定了滞绿突变体，并对相关基因进行了克隆，研究充分证实滞绿基因SGR在叶绿素降解中发挥重要功能，但有关滞绿基因的分子特征和生物学功能仍有待进一步研究。本实验利用Gateway技术构建适合于单子叶禾本科植物高羊茅遗传改良的RNAi载体，为高羊茅遗传改良提供技术支持，以期培育出高羊茅长绿期的新种质资源。

1　材料与方法

1.1材料

大肠杆菌（Escherichia coli）和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株，均为湖南农业大学草业科学研究所保存。BP Clonase Mix（Cat.No.11789 - 020）和LR Clonase Mix（Cat.No.11791 -020）购于Life Technology公司，2×SG PCR Master-Mix（#33 -10201）购于SinoGene Scientific，EasyPure Plant DNA Kit购于北京全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech），质粒小提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，卡拉霉素（Kanamycin）购于美国Sigma公司，其他化学试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物设计及目的片段的扩增

以高羊茅FaSGR基因CDS（coding region sequence）中心作为靶位点，设计引物Osgl869和Osgl870（表1）。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

以高羊茅‘猎狗5号’（Festuca arundinacea cv.Huntdog 5）50 d苗龄离体叶片提取总DNA为模板进行目的基因KOD - PLUS PCR扩增。

PCR反应体系（50 μL）：1.0 μL KOD - PLUS、5.0 μL 10×KOD - PLUS buffer、5.0 μL 2 mM dNTPs、2.0 μL 25 mM MgSO4、1.0 μL gDNA、1.5 μL Osgl869 Piemr（10 M）、1.5 μL Osgl870 Piemr（10 M）、23.0 μL ddH2O。

PCR反应程序：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35个循环后，于72℃延伸10 min。

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，确定有特异扩增后，再扩增2个50 μL体系的PCR，并进行PCR产物回收，测序验证后待用。

PCR产物回收：1）加入4倍体积的Buffer CP到1.5 mL离心管；2）剧烈震荡，短暂离心；3）把吸附柱放在收集管里；4）把步骤3的混合物转入吸附柱（每次750 μL，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心）；5）13 000 g离心1 min，弃滤液；6）加入700 μL洗脱液，13 000 g离心1 min，弃滤液；7）加入500 μL洗脱液，13 000 g离心1 min，弃滤液；8）13 000 g离心2 min，甩吸附柱上的乙醇；9）把吸附柱转到一个新的1.5 mL离心管，在吸附柱中心加入30 μL dd H2O，室温放置1 min；13 000 g离心2 min，滤液即是回收的DNA。

表1　引物及其基本特征Table 1 Primer sequences and its characters

1.2.2入门克隆的构建

利用Gateway技术构建RNAi表达载体，将PCR克隆得到验证的目的片段用于BP Clonase Reaction。

BP反应采用10 μL体系：在0.5 mL eppendorf管中，加入回收的目的片段4 μL，pDONR221 2 μL，TE Buffer（pH8）0.2 μL，BP Clonase 2 μL。轻轻摇匀，短暂离心。25℃放置1 h后，4℃过夜。加入1 μL Proteinase K，混匀，37℃连接10 min。此反应产物为含有目的基因的入门载体pENTR -870 -1，用于转化。

将载体pENTR -870 - 1用冻融法转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化细胞均匀涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12～16 h长出菌落，挑取单克隆到含有相同卡那霉素的LB液体培养基，再振荡培养。

以入门载体pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV进行PCR菌落鉴定，并测序。用试剂盒提取入门载体质粒，测定质粒浓度，用于后续LR反应。

1.2.3pANDA - B -870载体构建

利用LR重组反应将pENTR - 870 - 1入门载体里的目的片段转移到终载体中。

LR反应采用10 μL体系：在0.5 mL eppendorf管中加入pENTR -870 -1 4 μL，pANDA - B 2 μL，TE Buffer pH8 0.2 μL，LR Clonase 2 μL，25℃放置1 h后，4℃过夜。加入1 μL Proteinase K，混匀，37℃连接10 min。此反应产物为终载体pANDA - B -870 -3。将载体pANDA -B -870 -3用冻融法转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化细胞均匀涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养12～16 h长出菌落，挑取单克隆到含有相同卡那霉素的LB液体培养基，再振荡培养。进行PCR菌落鉴定和测序。

1.2.4根癌农杆菌表达克隆载体

将测序验证正确的阳性克隆载体pANDA - B -870 -3，用电击法转至农杆菌EHA105，以特异性引物Osgl869和Osgl870进行PCR扩增验证阳性菌落，同时以未转化的农杆菌EHA105做阴性对照，以含有pANDA -B -870 -3质粒的大肠杆菌菌液作为阳性对照。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2　结果与分析

2.1目的片段的获得与验证

以FaSGR基因CDS中心作为靶位点，设计引物Osgl869和Osgl870，克隆得到该目的片段，1.0%的琼脂糖电泳检测和预期结果一致（图1），测序长度512 bp。利用CLUSTALW进行FaSGR基因与Gen-Bank下载SGR参考序列（non - yellowing protein，GenBank登录号319430080），序列比对显示FaSGR基因与该序列同源性为97%（图2）。

图1　FaSGR目的基因的扩增Fig.1 Amplification of FaSGR gene

图2　FaSGR基因的序列同源性比较分析Fig.2 Comparative analysis of sequence homology of FaSGR gene

2.2入门载体阳性克隆检测

以FaSGR基因CDS中心作为靶位点，设计引物Osgl869和Osgl870，克隆得到该目的片段后，将目的片段经BP反应后，转入到pENTR -870 -1入门载体。pENTR - 870 - 1载体转入大肠杆菌后经培养获得单克隆，随机挑选6个单克隆，以入门载体pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV进行PCR菌落鉴定，所得片段大小接近768 bp（图3）。选择第1泳道PCR产物进行测序，测序结果和目的片段比对，同源性为100%，证明入门克隆构建成功。

图3　入门载体阳性克隆检测Fig.3 Detection of positive clones’pENTR vector

2.3表达载体的阳性克隆检测

经LR反应，将pENTR -870 -1入门载体上的SGR目的片段转移到目的载体上，进而构建Ubiquitin启动子驱动的pANDA - B -870 -3表达载体，该载体携带Hyg抗性（图4）。

为了验证目的片段（RNA干涉片段）是否同时正确插入到表达载体的位点上，随机挑选4个pANDA - B -870克隆进行质粒提取，以Osgl869和Osgl870这对引物对其进行PCR验证。电泳结果表明，挑取的4个克隆均为阳性（图5）。进一步测序，与目的片段比对，同源性为100%，证明表达克隆构建成功。

图4　构建的植物表达载体结构简图Fig.4 The structural diagram of constructed plant expression vector

图5　质粒PCR鉴定Fig.5 Identification of recombinant plasmids with PCR

2.4转化农杆菌及其验证

本实验通过电击法将含有Ubiquitin启动子驱动的pANDA - B - 870 - 3载体转入农杆菌，并以Osgl869和Osgl870这对引物对已转化的EHA105菌液进行PCR扩增，检测其是否含有表达载体。以未转化EHA105菌液做阴性对照，以含有pANDA -B -870 -3质粒的大肠杆菌菌液作为阳性对照。电泳结果表明，大肠杆菌菌液和转化的EHA105菌液均为阳性克隆，而未转化EHA105菌液无条带出现（图6）。

图6　大肠杆菌转化菌株的PCR鉴定Fig.6 Identification of transmitted Agrobacterium tumefacien strains with PCR

3　讨论和结论

3.1RNAi载体构建方式

目前，大部分RNAi载体构建采用的是以酶切链接为基础的传统构建方法［4，5］，需要经过多步克隆和酶切连接才能完成目的基因反向重复插入表达载体，这种构建方法复杂，实验周期长，不利于大规模基因功能研究，效率较低。Gateway技术是由Invitrogen公司开发的一种通用型克隆方法。Gateway技术利用位点特异性重组，只需将目的基因亚克隆到入门载体上，就可以利用重组技术将目的基因连接到目的载体上［6］。本实验采用高通量Gateway克隆技术进行高羊茅SGR基因的RNAi载体构建，这种方法只需要采用特定的重组试剂盒，不需要传统酶切连接过程中限制酶和连接酶的使用，在其他单子叶植物中有成功利用，技术成熟。

3.2植物RNAi载体系列

广泛应用于植物转基因实验的RNAi载体有pHANNIBAL，pHellsgate系列，pEARLYGATE系列和pANDA系列等［7］。张卓等利用pHANNIBAL构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体［8］；王聪颖等利用pHellsgate - 8构建了黄瓜HPL基因的RNAi表达载体［9］；易金鑫等利用pEARLYGATE103构建了CHS8、IFS2和CHS8 + IFS2表达载体［10］；朱丽等利用pANDA -35HK构建了水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的表达载体［11］。其中，pANDA系列载体在单子叶植物中应用较多，可以快速高效构建RNAi载体，直接转入到叶细胞和原生质体中，还可用于水稻功能基因的瞬态抑制。该载体有助于识别水稻基因的突变体标记，在实验中干扰效率高达90%［12］。本实验应用pANDA系列载体构建了高羊茅FaSGR基因的RNAi载体，将FaSGR基因插入pANDA - B中，并成功将其导入农杆菌中。

3.3构建SGR基因载体的启动子

植物基因的表达受到上游启动子特征的调控。在利用基因工程技术进行转基因植物的研究时，高效率地表达目的基因最为关键的是启动子的选择。花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）是目前研究较清楚、且在转基因研究和应用中使用最多的启动子［13］。目前运用35S启动子构建SGR基因RNAi载体的物种包括雪里蕻［14］、紫花苜蓿［15］和大豆［16］等，并获得了转基因植株。同时，在对拟南芥滞绿基因AtNYE1研究时发现，AtNYE1全长启动子（1882 bp）驱动Gus的表达呈组成型特征，且具有与35S启动子类似或更强的驱动下游基因表达的功能［16］，该启动子在今后转基因的研究和应用中可能具有潜在的价值。

本实验采用的启动子是Ubiquitin（Maize ubiquitin promoter）启动子。Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），是一个在单子叶植物中有较强表达的启动子。Ubiquitin启动子与CAT编码区的融合基因（Ubipro CAT）在玉米原生质体中的表达强度是35S启动子与CAT编码区的融合基因（35Spro CAT）表达强度的10倍［17］。双子叶植物中一般采用35S启动子，而在单子叶植物中，Ubiquitin是一个具有较强表达活性的启动子［18］。目前还没有发现这类启动子在SGR基因上有所应用。本实验结果表明，高羊茅内源SGR基因的RNAi载体在农杆菌中可正常表达。后续实验将利用农杆菌介导技术将pANDA - B - 870 - 3载体转入至高羊茅体内表达，产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA，引起具有SGR相同序列的mRNA发生降解，从而沉默SGR基因的表达，引导植物个体发生形态学或生理变异。

本实验成功构建了FaSGR内源基因的RNAi植物表达载体pANDA - B -870 -3，为高羊茅下一步的遗传转化，选育长绿期的新高羊茅种质资源奠定了技术基础。

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Construction of RNAi Expression Vector for FaSGR Gene of Tall Fescue

WEN Zhaozhu1，SHANG Dan1，GONG Lixia1，ZHANG Zhifei1，2*
（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Grassland Science Department，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：In this study，RNAi vector pANDA-B-870 with hygromycin resistance for tall fescue FaSGR gene drove by Ubiquitin promoter was constructed using the Gateway technology，which was suitable for genetic transformation of monocots.The pANDA-B-870 vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 competent cells by electroporation method，the transformation was confirmed by PCR.The construction of RNAi vector for FaSGR gene provided technical support for further study of FaSGR gene’s function and the application of SGR of tall fescue in genetic improvement.

Keywords：tall fescue；FaSGR gene；vector construction；RNA interference；Gateway technology

中图分类号：Q782

文献标识码：A

文章编号：1001-5280（2016）03-0241-06

DOI：10.16848/ j.cnki.issn.1001-5280.2016.03.02

收稿日期：2016- 01- 13

作者简介：文昭竹（1990 -），女，硕士研究生，Email：ningjiuzhubeibei@163.com。*通信作者：张志飞，副教授，Email：zzf0917@ aliyun.com。

基金项目：中国博士后科学基金项目（2014M560643）；湖南省教育厅优秀青年基金（14B083）；湖南农业大学研究生创新项目。