优美毡被孔菌培养条件的研究

刘叶明，郭丹萍

（1. 大连诚泽检测有限公司，辽宁 大连 116000； 2. 金州新区先进街道金润社区，辽宁 大连 116199）



优美毡被孔菌培养条件的研究

刘叶明1，郭丹萍2

（1. 大连诚泽检测有限公司，辽宁 大连 116000； 2. 金州新区先进街道金润社区，辽宁 大连 116199）

摘 要：优美毡被孔菌是一种具有危害性的真菌，需要研究最佳培养条件，找到有效防治手段。采用生长速率法，研究了影响优美毡被孔菌菌丝生长和菌落形态的参数（包括温度、pH值、碳源、氮源），并调查了不同药物对该菌的抑制培养实验。结果表明，菌丝体生长最适培养温度范围为25～35 ℃；优美毡被孔菌对酸碱的选择性很差，pH值的变化对其生长速度的影响不大；最适培养碳源为淀粉；最适培养氮源为酵母汁；0.5～10 g/L福美胂可以作为该菌的有效抑制剂。这些结果为优美毡被孔菌有效防治提供有力证据。

关 键 词：优美毡被孔菌；培养研究；最适培养条件；药物抑制

多孔菌是大型真菌中一个重要类群，属于担子菌门、非褶菌目，泛指多孔菌科、刺革菌科、灵芝菌科和刺孢多孔菌科等担子果具有孔状结构的种类［1-4］。其中有些多孔菌因为其子实体和菌丝中含有的多糖而具有免疫调节功能和抗癌作用，具有极高的药用价值［5，6］。

优美毡被孔菌（Spongipellis delectans），分类地位［7］为担子菌门、担子菌纲、非褶菌目、多孔菌科、毡被菌属。优美毡被孔菌通常专性寄生在栎属树木特别是蒙古栎上，造成心材白色腐朽，在天然林内最常见，通常在活立木树或垂死树木上形成多个单生的子实体，该菌既侵染大树，也危害小树和幼树，能直接造成树木死亡［8］。

本文研究选取优美毡被孔菌进行室内培养和研究，探讨其生物学习性和菌丝体生长特性，并选取该菌的不同浓度的四种抑制剂进行对比，以期发现对该菌有效的防治手段。

1 实验部分

1.1 材料

优美毡被孔菌（Spongipellis delectans）菌丝体，由中国科学院沈阳应用生态研究所在野外考察时采集后，分离纯化取得；PDA培养基（分别称取马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼胶20 g后，加水定容至1 000 mL）；麦芽汁琼脂培养基（分别称取麦芽膏25 g，琼脂17 g后，加水定容至1 000 mL）；无碳培养基（分别称取KNO33 g，KH2PO41.2 g， K2HPO40.4 g，MgSO40.5 g后，加水定容至1 000 mL）［9］；无氮培养基（分别称取葡萄糖20g， KH2PO41.0 g， K2HPO40.4 g， MgSO40.5 g后，加水定容至1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 菌丝对温度的选择试验

以PDA培养基为基础培养基，在温度10～40℃，级差5 ℃的条件下，进行平板培养，将优美毡被孔菌分别做7个温度级别处理，重复3次，培养菌丝体并检测出其最适生长温度后，采用其最适温度作为进行后续试验培养温度。

1.2.2 菌丝对培养基pH值的选择试验

在培养皿中倒入以麦芽汁琼脂培养基，并在灭菌前采用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl进行pH值的调节，从5.0～9.0，级差0.5，将优美毡被孔菌做9个pH级别处理，每个级别进行3次实验，取3次菌落直径的平均值。

1.2.3 菌丝对碳源的选择试验

将葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，甘露醇，可溶性淀粉作为碳源，分别加入无碳培养基中，其终浓度均为20 g/L，将优美毡被孔菌分别接种在上述碳源的培养基中，每种碳源培养基进行3次实验，取3次菌落直径的平均值。

1.2.4 菌丝对氮源的选择试验

将蛋白胨，尿素，牛肉浸膏，酵母汁，硫酸铵作为氮源，分别加入无氮培养基中，其终浓度均为20 g/L，将优美毡被孔菌分别接种在上述氮源的培养基中，每种氮源培养基进行3次实验，取3次菌落直径的平均值。

1.2.5 菌丝体的药物抑制选择试验

对PDA培养基为基础培养基进行灭菌，并分别加入定量的根腐宁、甲基托布津、多菌灵、福美胂倒入培养皿中，并采用上述药物终浓度为0.5、1.0、5.0、10.0 g/L分别对优美毡被孔菌进行处理，取3次菌落直径的平均值。

1.2.6 统计学处理

（1）菌丝生长速度：根据每种菌丝生长速度的差异，每隔一定时间测量一次菌落直径（选取所接菌块中心为坐标系原点，分别做X轴与Y轴，取菌落在X轴与Y轴的直径的平均值）。菌丝生长速度=［（菌落直径-原始菌种块边长）/2］/培养天数，单位：cm/d。

（2）菌丝生长期：开始萌发时间、满皿时间（单位：d），接入的培养基菌落直径为：0.70 cm；长满平皿时的菌落直径为：8.50 cm。

2 实验结果

2.1 不同温度对菌丝体的影响

如图1所示，相对而言，优美毡被孔菌最适温度为25～35 ℃，在低于25 ℃或高于35 ℃的温度条件下，菌丝体生长相对变得缓慢，培养第6 d时，在30 ℃时生长速度最大，为0.619 cm/d，而此时菌落直径为8.13 cm。优美毡被孔菌生长最快的处理长满培养皿时间为8 d。

图1 优美毡被孔菌在整个生长周期中不同温度下的菌落直径和生长速度对比Fig.1 The comparison of colony diameter and growth rate at different temperature for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.2 不同pH值的培养基对菌丝体的影响

如图2所示，优美毡被孔菌对酸碱的选择性不明显，在菌落直径的变化图中，有几条折线几乎重叠在一起，说明培养基pH值的变化对其生长速度的影响不大，在培养第5 d时，pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0条件下的菌丝直径为4.22、5.13、3.97、4.53、4.87、4.85、4.88、5.33和5.05 cm，这个结果提示在微酸或微碱的环境中，菌丝体均可以生长，长满培养皿一般需要6 d。

图2 优美毡被孔菌在整个生长周期中不同pH下的菌落直径和生长速度对比Fig.2 The comparison of colony diameter and growth rate at different pH for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.3 不同碳源培养基对菌丝体的影响

图3 优美毡被孔菌在整个生长周期中不同碳源下的菌落直径和生长速度对比Fig.3 The comparison of colony diameter and growth rate at different carbon source for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如图3所示，浓度均为20 g/L的不同碳源对优美毡被孔菌菌丝体的生长速度有显著影响，各种碳源培养基中的菌落形态几乎相同，菌落较薄且稀疏；而在添加淀粉的培养基中，菌落菌丝密度相对比较大，但与PDA培养基相比却要稀疏。培养第7天时，添加葡萄糖的培养基菌落直径为6.77 cm、蔗糖为6.43 cm、麦芽糖为5.90 cm、甘露醇为5.93 cm、淀粉为7.47 cm。可以看出，相对而言，添加淀粉的培养基更适合优美毡被孔菌生长，大约用8 d可以长满培养皿。

2.4 不同氮源培养基对菌丝体的影响

如图4所示，在20 g/L的浓度下生长最快的处理用了8 d时间长满整个培养皿，且优美毡被孔菌对各种氮源的选择性较明显，酵母汁对该菌的生长作用很强，其次是蛋白胨和牛肉膏，但是在添加硫酸铵的培养基中，对菌丝生长的促进作用不明显，而在添加尿素的培养基中，菌丝几乎没有生长。各个培养基中，菌落较薄且稀疏。培养第5 d时，优美毡被孔菌在添加蛋白胨为氮源的培养基上菌落直径为5.07 cm、尿素为0.70 cm、牛肉膏为4.50 cm、酵母汁为5.38 cm、硫酸铵为1.97 cm，因此，酵母汁在上述浓度均为20 g/L的氮源中，是相对最好的氮源。

图4 优美毡被孔菌在整个生长周期中不同氮源下的菌落直径和生长速度对比Fig.4 The comparison of colony diameter and growth rate at different nitrogen source for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.5 各种抑制剂在不同浓度下对菌丝体的影响

2.5.1 同浓度（0.5 g/L）的各种抑制剂对菌丝体影响

图5 优美毡被孔菌在整个生长周期中的0.5 g/L不同药物下的菌落直径和生长速度对比Fig.5 The comparison of colony diameter and growth rate at 0.5 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如图5所示，分别添加浓度为0.5 g/L四种药物（○a根腐宁、○b甲基托布津、○c多菌灵、○d福美胂）的PDA培养基对优美毡被孔菌生长速度的影响很大，培养第5 d时，分别含根腐宁和甲基托布津的培养基菌落直径均为0.70 cm、而含多菌灵的培养基菌落直径为7.36 cm、福美胂的培养基菌落直径为6.90 cm。这表明，在添加浓度为0.5 g/L的四种抑制型药物的PDA培养基中，根腐宁和甲基托布津的抑菌作用最强，接种的菌丝体几乎无生长迹象，甚至菌丝萎缩死亡，而培养初期多菌灵的抑菌作用比福美胂的作用强，后期相反。

2.5.2 同浓度（1.0 g/L）的各种抑制剂对菌丝体影响

如图6所示，分别添加浓度为1.0 g/L上述四种药物的PDA培养基对优美毡被孔菌生长速度的影响很大，培养第5 d时，分别含根腐宁和甲基托布津的培养基菌落直径均为0.70 cm、而含多菌灵的培养基菌落直径为7.33 cm、福美胂的培养基菌落直径为6.43 cm。这表明，在添加浓度为1.0 g/L的四种抑制型药物的PDA培养基中，根腐宁和甲基托布津的抑菌作用最强，接种的菌丝体几乎无生长迹象，甚至菌丝萎缩死亡，而培养初期多菌灵的抑菌作用比福美胂的作用强，后期相反。

图6 优美毡被孔菌在整个生长周期中的1.0 g/L不同药物下的菌落直径和生长速度对比Fig.6 The comparison of colony diameter and growth rate at 1.0 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.5.3 同浓度（10.0 g/L）的各种抑制剂对菌丝体影响

图7 优美毡被孔菌在整个生长周期中的10.0 g/L不同药物下的菌落直径和生长速度对比Fig.7 The comparison of colony diameter and growth rate at 10.0 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如图7所示，分别添加浓度为10.0 g/L上述四种药物的PDA培养基对优美毡被孔菌生长速度的影响很大，培养第5 d时，分别含根腐宁和甲基托布津的培养基菌落直径均为0.70 cm、而含多菌灵的培养基菌落直径为7.17 cm、福美胂的培养基菌落直径为4.33 cm。这表明，在添加浓度为10.0 g/L的四种抑制型药物的PDA培养基中，根腐宁和甲基托布津的抑菌作用最强，接种的菌丝体几乎无生长迹象，甚至菌丝萎缩死亡，而福美胂的抑菌作用比多菌灵的作用强。

3 讨论与结论

优美毡被孔菌相对最适温度范围为25～35℃，同时该菌还表现出对高温的耐受性，在40 ℃时菌丝体有一定的生长。由于优美毡被孔菌在25～35 ℃均表现出类似的生长情况，所以该菌生长的最适温度还有待于进一步研究。优美毡被孔菌在不同的酸碱环境中，对其生长速度的影响不大，因此需要进一步通过试验论证。在添加不同碳源的培养基中，优美毡被孔菌的菌丝体密度均很小，菌落分布较薄且稀疏。分析其原因可能是添加碳源的质量百分比不够，或者是因为培养时间不够长，有待于进一步试验论证。不同的碳源对优美毡被孔菌的生长速度有显著影响，相对最好的碳源为淀粉，揭示出该菌对多糖的利用率较高。优美毡被孔菌在添加量中浓度的氮源培养基上长势良好，大多数菌丝体的密度大，菌落较厚。优美毡被孔菌对各种氮源的选择性较明显，随着氮源浓度的降低，菌落满盘的时间缩短，蛋白胨的作用逐渐强于酵母汁。有两点原因可能导致尿素抑制菌丝体的生长：（1）选取的尿素浓度过高；（2）菌丝体中没有能够利用尿素的酶。四种药物以根腐宁和甲基托布津的抑菌作用最强，优美毡被孔菌在选取的四种浓度中都无法生长，可以作为该菌的有效抑制剂，但是需要通过进一步实验得到抑制该菌生长的最低浓度。福美胂对优美毡被孔菌的抑菌作用随着浓度增加而加强的程度很大，而多菌灵对优美毡被孔菌的抑菌作用随着浓度增加而发生的变化不是很大。所以可以断定，在多菌灵和福美胂中，后者的抑菌作用要强于前者，相对来说，可以选取浓度为0.5～10 g/L的福美胂作为该菌的有效抑制剂。

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Study on Culture Conditions of Spongipellis Delectans

LIU Ye-ming1，GUO Dan-ping2
（1. Dalian Chengze Testing Services Co.， Ltd.， Liaoning Dalian 116000，China；2. Jinrun Community， Xianjin Street， Jinzhou New District， Liaoning Dalian 116199，China）

Abstract:As a kind of fungus with destructive nature， optimal culture conditions of Spongipellis delectans were studied in order to find the approach of effective prevention and control. The factors to affect Spongipellis delectans growth rate and the colony morphology were studied by using the growth rate method， such as temperature， pH，carbon source and nitrogen source. Inhibition effect of different drugs on Spongipellis delectans was investigated. The results show that the optimum temperature for its growth is from 25 ℃to 35 ℃. The acid-base selectivity of the mycelium is very poor， and the change of pH has little effect on the growth speed. The optimum carbon source of culture is starch， and the optimum nitrogen source of culture is yeast juice. After contrasting different concentrations of its four inhibitors， 0.5～10 g/L Asomate can be used as a potent inhibitor of Spongipellis delectans.

Key words:Spongipellis delectans； Cultural study； Optimal culture condition； Pharmacological inhibition

中图分类号：TQ 028

文献标识码：A

文章编号：1671-0460（2016）02-0259-04

收稿日期：2015-12-09

作者简介：刘叶明（1982-），男，辽宁省大连市人，中级工程师，硕士，2008年毕业于大连理工大学生物化学与分子生物学专业，研究方向：从事微生物菌种鉴定工作。E-mail：ymliu_bio@foxmail.com。