GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义

买合木提·阿吾提， 练春频， 欧庆健， 姜晓曼， 徐国彤， 吕立夏

(1. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092； 2. 同济大学医学院干细胞研究中心，上海 200092)



·基础研究·

GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义

买合木提·阿吾提1，2， 练春频1，2， 欧庆健1，2， 姜晓曼1，2， 徐国彤1，2， 吕立夏1，2

(1. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092； 2. 同济大学医学院干细胞研究中心，上海 200092)

目的 探讨胶质细胞成熟因子beta(GMFB)在氧化应激诱导的ARPE19细胞中的表达及意义。方法 用0、0.25、0.5、1、2mmol乙二醛处理ARPE19细胞24h，其中对照组用0mmol/L乙二醛处理，实验组以0.25～2mmol/L 乙二醛处理，用Western印迹法检测GMFB的表达；实验组用1μg/ml GMFB处理ARPE19细胞24h，对照组不做处理，进行RNAseq，比较实验组和对照组基因表达的差异，选取其中表达差异大于1.5倍且P<0.05的基因作为差异表达的基因，对其进行GO及KEGG富集分析。结果 经乙二醛处理的各组ARPE19细胞GMFB表达上调，以0.5mmol/L处理组的GMFB上调最为显著。对GMFB处理的ARPE19细胞进行全基因表达谱检测，结果显示，在被检测的19966个基因中，实验组和正常组间有显著差异表达(改变1.5倍)的基因有583个。与对照组相比，实验组基因表达显著上调的有265个，下调的有318个。GO分析表明，GMFB与细胞代谢、细胞催化等生物过程相关。KEGG分析显示，GMFB与细胞代谢通路、癌症通路、Wnt信号通路、趋化因子信号通路等多条信号通路密切相关。炎症基因CCL26、CXCL8和NF-κB1表达升高，提示GMFB与炎症相关。结论 GMFB在氧化应激诱导的ARPE19细胞中表达明显上调，GMFB可能影响细胞间连接，参与Wnt信号通路、肿瘤相关信号通路和趋化因子信号通路等。

氧化应激； 胶质细胞成熟因子beta； 视网膜色素上皮细胞

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration， AMD)是一种严重损害老年人视力的进行性疾病，病理原发部位是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium， RPE)细胞[1]。AMD的病因和发病机制尚不明确，但其发展与氧化应激及其和诱导的细胞衰老有关[2]。神经胶质成熟因子-beta(glia maturation factor beta， GMFB)是从脑组织提取得到的一种酸性蛋白质，主要在中枢神经系统中星型胶质细胞和一些神经元表达[3-4]。在星型胶质细胞过表达GMFB能引起SOD活性增高，引发氧化应激[5]，而GMFB敲除小鼠的星型胶质细胞的抗氧化应激能力增高、炎症因子释放减少[6]。哺乳动物的视网膜是特化的中枢神经系统，目前尚未见GMFB对视网膜RPE细胞影响的相关报道。乙二醛促进末端糖基化产物的产生引起活性氧增多、蛋白质羰基化、线粒体膜电位改变因而产生氧化应激[7-8]。本研究采用乙二醛处理的ARPE19细胞为研究对象，检测其在氧化应激条件下GMFB的表达，并采用GMFB处理ARPE19细胞后进行RNAseq检测，对差异表达的基因进行GO、KEGG分析，旨在了解GMFB在RPE氧化应激下RPE细胞中的功能，为RPE细胞病变引起AMD提供线索。

1 材料与方法

1.1 试剂及材料

DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；抗GMFB抗体购自Proteintech公司；羊抗兔-HRP、RIPA、PMSF购自Beyotime公司；TEMED、SDS、低温离心机购自Sigma公司；基因芯片由华大基因测序；激光共聚焦显微镜购自Nikon公司；细胞培养箱购自Thermo公司；蛋白电泳及转膜仪购自Bio-Red公司；人GMFB蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司(货号： 13244-HNAE-100)。Lipo-FiterTM脂质体转染试剂购自汉恒生物科技(上海)有限公司。GMFB siRNA(scramble)由百奥迈科生物技术有限公司合成。上游引物： 5′-GCCGAAGAUUUAGUGGAAAdTdT-3′，下游引物： 5′-UUUCCACUAAAUCUUCGGCd-TdT-3′。

1.2 细胞培养及处理

ARPE19细胞在含10%牛胎血清及1%青霉素- 链霉素的DMEM/F12培养基中培养，培养条件为37℃、5% CO2。2～3d传代1次。0、0.25、0.5、1、2mmol/L 的乙二醛处理细胞24h后收样，其中对照组为0mmol/L乙二醛处理，实验组以0.25～ 2mmol/L 乙二醛处理，用Western印迹法及免疫荧光检测GMFB表达。实验组用1μg/ml GMFB处理细胞24h，对照组未作处理，TRIzol收样，用基因芯片进行分析。

1.3 Western印迹法检测蛋白表达水平

收集的细胞用RIPA裂解液裂解后，提取蛋白样品，以20μg/孔上样进行SDS-PAGE电泳，并进行蛋白转印至PVEF膜上。用兔源抗GMFB抗体及抗兔HRP标记的二抗检测GMFB的表达。以Actin作为对照内参。

1.4 免疫荧光染色检测乙二醛处理细胞中的GMFB的表达

细胞接种于预置在24孔板培养皿中的玻片上，待细胞贴壁达到70%～80%融合后，取出玻片。经4%多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100透膜后，用抗人GMFB以及相应种属来源的CY3标记的二抗进行孵育，用DAPI染细胞核，DAKO封片于载玻片上，共聚焦显微镜下观察。

1.5 GMFB siRNA转染

转染前1d，将细胞置于6cm细胞培养板上，第2天待细胞融合达到50%～70%备用。GMFB siRNA根据说明书稀释并根据Lipo-FiterTM脂质体转染试剂说明书进行转染。scramble siRNA作为对照。转染6h后换细胞培养液，继续培养24h，再0.5mmol/L乙二醛处理24h。

1.6 MTT检测细胞增殖

胰酶消化细胞制成细胞悬液，浓度调整为5×104～10×104/ml，接种于96孔板中，每孔100μl。GMFB对ARPE19细胞活性影响实验： 加含有1μg/ml GMFB的培养液100μl，置培养箱孵育24h。GMFB siRNA沉默后MTT检测实验。设4个组： NC组(正常对照组)、0.5mmol/L乙二醛(glyoxal)处理组、GMFB siRNA转染后0.5mmol/L乙二醛处理组和scramble siRNA转染后0.5mmol/L乙二醛处理组。细胞处理完在避光下每孔加入10μl(5mg/ml)的MTT溶液，培养箱孵育4h。吸去孔内培养液，加入100μl DMSO，摇床轻摇10min至结晶完全溶解。用酶标仪检测490nm处吸光度(D490)。实验设置调零孔、对照孔、实验孔，每孔设5个复孔。

1.7 RNAseq检测差异表达的基因

RNAseq检测的方法： 样品提取总RNA后经过利用Oligo(dT)富集mRNA，mRNA片段化，cDNA合成，末端修复、加A、加接头后PCR扩增等步骤完成整个文库的制备。文库进行质量和产量检测，文库质控合格后用Illumina HiSeqTM 2000进行测序，原始数据经去除杂质数据等处理后得到的数据为有效数据。对有效数据进行统计分析。

1.8 差异表达基因的基因本体及通路分析

对差异表达基因进行基因本体(gene ontology， GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)信号通路分析。将RNAseq得到的有效数据中处理组与对照组进行比较，差异倍数≥1.5且P<0.05视为差异表达基因。对于筛选的基因用GO数据库和注释、可视化和整合发现数据库(DAVID)进行GO和KEGG分析。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 乙二醛处理后ARPE19细胞中GMFB的表达

0～2mmol/L乙二醛处理ARPE19细胞24h，Western印迹法检测显示，0.5mmol/L浓度处理时，GMFB表达明显升高(图1A)。以0.5mmol/L乙二醛处理ARPE19细胞24h，用免疫荧光观察细胞中GMFB的表达，发现乙二醛处理组GMFB表达升高(图1B)，提示GMFB在氧化应激刺激的ARPE19细胞中表达升高。

2.2 GMFB对ARPE19细胞活力的影响

用重组蛋白GMFB(1μg/ml)处理细胞24h，MTT结果显示： GMFB处理后ARPE19细胞活性明显降低，为对照组的70%，差异有统计学意义(P<0.001)。以siRNA沉默GMFB后，0.5mmol/L 乙二醛处理细胞24h，Western印迹法检测GMFB的表达，结果显示siRNA沉默后乙二醛处理组中GMFB表达比单独乙二醛处理组显著降低，说明siRNA沉默GMFB的效果明显(图2A)。以同样的方法处理ARPE19细胞检测细胞活性，0.5mmol/L乙二醛处理时细胞活性显著降低(P<0.05)。而GMFB沉默后细胞活性升高(P<0.05)，提示GMFB沉默改善乙二醛引起细胞活性降低(图2B)。

2.3 基因芯片检测中两组间差异表达的基因

为探究GMFB对ARPE19细胞的影响，以1μg/ml GMFB处理ARPE19细胞24h并以未处理组作为对照组，提取总RNA进行RNAseq分析。共检测到19966个基因。与对照组相比，GMFB处理导致1.5倍差异表达的基因有583个，其中表达上调的有265个，下调的有318个。对差异表达的基因进行GO富集分析和KEGG分析。Western印迹法和免疫荧光染色实验重复3次。

图1 GMFB在乙二醛处理的ARPE19中的表达Fig.1 Expression of GMFB in glyoxal treated ARPE19 cellsA： Western印迹法检测不同浓度乙二醛处理ARPE19细胞24h的结果；B： 免疫荧光染色检测结果，GMFB表达在细胞浆中；标尺： 50μm；Western印迹法和免疫荧光染色实验重复3次；与NC组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 GMFB沉默改善乙二醛引起ARPE19细胞活性的降低Fig.2 GMFB knockdown rescue glyoxal induced decreased cell viability in ARPE19 cellsA： Western印迹法检测GMFB沉默效果，Western印迹法实验重复3次；B： ARPE19细胞同(图A)方法处理后，以MTT检测细胞活性；与NC组比较，*P<0.05；与GMFB处理干扰组比较，#P<0.05

2.4 差异基因的GO功能分析

为详细研究基因的功能分类，通过GO对差异表达基因的分析，可将差异表达的基因按功能分为： 生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大类，见图3。GO富集分析显示，表达上调的基因分为以下几类： 代谢过程(6-磷酸果糖-2-激酶/果糖- 2，6-二磷酸酶，1-磷酸甘露糖鸟苷酰转移酶)，刺激反应(白细胞介素-8、趋化因子-26、血管内皮生长因子)，蛋白结合(连环蛋白beta1)。表达下调的基因分为以下几类： 细胞过程(包括细胞通讯、细胞周期、细胞增殖、细胞成分的运动、染色体分离、胞质分裂等过程以及转化生长因子beta3)和生物调节(包括稳态过程、生物过程调控、分子功能调节、纤溶酶原激活物抑制剂)等。

图3 表达差异基因的GO富集分析Fig.3 GO annotation of the differentially expressed genesA： 表达上调基因的GO富集分析；B： 表达下调基因的GO富集分析

2.5 差异基因的KEGG信号通路分析

KEGG分析表明，共有93条信号通路与差异表达的基因相关。根据上、下调基因及P值，最有相关性(P值最小)的10条上调和下调基因的KEGG通路见表1～2。结果显示： 多条参与代谢的通路发生上调，如： 果糖和甘露糖代谢通路(fructose and mannose metabolism)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、神经营养因子的信号转导通路(neurotrophin signaling pathway)。而MAPK信号通路、细胞外基质相关Focal adhesion、 ECM-receptor interaction等信号通路的基因下调。

表1 上调基因的KEGG相关信号通路分析

表2 下调基因的KEGG相关信号通路分析

3 讨 论

氧化应激是AMD发生的重要病理机制之一，通过诱导RPE细胞释放炎症因子加重RPE细胞的损伤，促进AMD的进展[9]。

目前，关于GMFB的研究多在神经系统和神经疾病领域。GMFB是一种细胞内源性蛋白，参与细胞信号转导调节。GMFB在初级星形胶质细胞中高表达，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)P38而引起神经营养因子的分泌[10]，说明GMFB蛋白在应激激活信号转导中起作用[11]。

哺乳动物的视网膜是典型的中枢神经系统，其包含的主要细胞有： 节细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、视杆细胞、视锥细胞和Müller细胞。对视网膜中GMFB的研究较少。Nishiwaki等[12]发现大鼠视网膜能表达GMFB，用原位杂交检测发现视网膜GMFB的mRNA信号从胚胎14d到成年表现为阳性，而免疫组织化学实验进一步显示，GMFB蛋白表达在胚胎14d到出生后1d龄大鼠的视网膜内核层中，到成年期则表达在Müller细胞中，认为GMFB在视网膜神经细胞和胶质细胞的生长和发育中起非常重要的作用。

目前，GMFB在视网膜疾病中的作用尚未见到相关报道。RPE细胞是一层单层的色素细胞，它顶膜面是光感受器的光感外段，基底膜面是脉络膜和视网膜血管。RPE与其连接复合体构成紧密的功能界面[13]。RPE细胞的功能包括： 屏障功能、吞噬功能、参与视循环代谢、抗氧化功能和分泌生长因子。RPE细胞中发生氧化应激引起AMD[14]。乙二醛作为一种引起氧化应激的介质，在细胞中引起活性氧水平升高引起氧化应激[7-8]。本研究以乙二醛处理人视网膜色素上皮细胞系ARPE19细胞，发现在氧化应激诱导的APRE19细胞中GMFB的表达明显增加，提示GMFB在ARPE19细胞中与氧化应激有关的作用。GMFB重组蛋白处理ARPE19细胞时发现GMFB处理组细胞活性显著降低，而siRNA沉默GMFB时可以改善乙二醛引起ARPE19细胞的活性降低。提示GMFB与细胞的生存相关，GMFB在ARPE19细胞中起不良的作用。在深入探究GMFB在RPE细胞中作用的研究中，对GMFB处理组与未处理组的RNAseq筛选发现有520个基因有显著的差异表达。对筛选的基因进行KEGG分析发现，GMFB处理组中Wnt信号通路激活。Wnt信号通路控制多种发育过程和稳态[15]。研究[16]显示，在AMD动物模型的视网膜RPE中WNT信号通路被激活，β-catinen持续表达诱导血管生成和炎性因子，如VEGF、TNF-α、NF-κB，其表达均增多。本研究表明，在GMFB处理组中，β-catinen 和smad2表达增高，同时伴有VEGFA和NF-κB1表达增多，提示GMFB激活Wnt信号通路。在氧化应激的RPE中，很有可能通过Wnt信号通路来影响RPE细胞。

KEGG分析表明，GMFB处理组中趋化因子信号转导通路(chemokine signaling pathway)上调。而该通路在炎症中起重要作用。研究[17-18]表明，在氧化应激诱导的RPE细胞中炎症因子明显升高，在神经系统胶质细胞中的GMFB也引起炎症因子表达增加。GO富集分析发现，GMFB处理组中趋化因子CCL26和CXCL8表达增高，提示GMFB作用于RPE细胞引起炎症因子表达增加，在氧化应激诱导的RPE细胞中与炎症因子的释放相关。

通过KEGG分析还发现，GMFB处理组中细胞外基质相关的通路粘着斑(focal adhesion)形成，细胞外基质(extra cellular matrix， ECM)受体相互作用(ECM-receptor interaction)下调。ECM在RPE细胞的存活中有重要作用，为RPE细胞营养物质运输、物质代谢和信号转导提供稳定的内环境[19]。ECM也参与调节RPE细胞的分化、增殖、迁移和细胞黏附等生理过程[20-21]。研究[19]表明，AMD时细胞外基质调节会发生紊乱。本研究通过GO富集分析发现，参与ECM相关通路的基因collagen XI、heparan sulfate proteoglycan 2、integrin beta 3、filamin C 和thrombospondin 1等表达量均下降，提示GMFB影响RPE细胞的ECM，在氧化应激的RPE细胞外基质的调节中发挥作用。

综上所述，氧化应激能诱导ARPE19细胞中GMFB表达上调，并且GMFB主要影响ARPE19细胞炎症反应、细胞间连接和黏附功能，其机制可能是通过NF-κB和Wnt信号通路发挥作用。GMFB作用的分子机制值得进一步深入研究。

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Expression of Glia maturation factor beta in ARPE19
cells and its relation to oxidative stress

MaihemutiAwuti1,2，LIANChun-pin1,2，OUQing-jian1,2，JIANGXiao-man1,2，XUGuo-tong1,2，LYULi-xia1,2

(1. Dept. of Regenerative Medicine， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China；2. Stem Cell Research Center， Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China)

Objective To investigate the expression of glia maturation factor beta(GMFB) in human retinal pigment epithelium(RPE) ARPE19 cells and its relation to oxidative stress. Methods ARPE19 cells were treated with glyoxal(0， 0.25， 0.5， 1.0 and 2.0mmol/L) for 24h. GMFB expression levels were examined by Western blot. APPE19 was treated with 1μg/ml GMFB for 24h. Total RNA was extracted and used for RNAseq assay. By comparing the differentially expressed profile of two groups， the genes with expression difference fold >1.5 times andP<0.05 were selected as candidate genes for GO enrichment analysis and KEGG analysis. Results In the ARPE19 cells under the treatments of different concentrations of glyoxal， GMFB expression levels were significantly up-regulated. RNAseq analysis showed that the expression patterns of 583 genes significantly altered in experimental group， of which 265 were up-regulated and 318 were down-regulated. GO analysis indicated that GMFB was involved in the process of cellular metabolism. KEGG analysis further indicated that GMFB was involved in metabolic pathway， cancer pathway， Wnt signaling pathway and chemokine signaling pathway. Furthermore， inflammation related genes CCL26， CXCL8 and NFKB1 were also up-regulated. Conclusion Oxidative stress induces the up-regulation of GMFB in ARPE19 cells. The effects of GMFB on ARPE19 were related with cell-cell binding， Wnt signaling pathway， pathway in cancer as well as chemokine signaling pathway. The results indicate that GMFB is involved in important cellular process in RPE cells under oxidative stress and might be an important factor in the pathology of retinal degeneration.

oxidative stresss； glia maturation factor beta； retinal pigment epithelium； nuclear factor of kappa B

10.16118/j.1008-0392.2016.05.002

2016-04-22

上海市卫生和计划生育委员会项目(201640229)

买合木提·阿吾提(1988—)，男，硕士.E-mail： bandit40@126.com

吕立夏.E-mail： lulixia@tongji.edu.cn

R 329.2+6

A

1008-0392(2016)05-0006-08