黄芩苷对胃癌BGC—823、MGC—803细胞迁移能力的影响

王宏伟 徐燕 李海龙 陈凤琴 吴红彦

摘要：目的 观察黄芩苷对胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移的影响，探讨其可能的作用机制。方法 划痕实验和Transwell小室观察Toll样受体（TLR）激活后以及黄芩苷干预TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移能力；RT-qPCR和Western blot检测胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、激活蛋白-1（AP-1）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果 脂多糖（LPS）可促进胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移，黄芩苷可抑制LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移；LPS可上调TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达，黄芩苷可下调LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达。结论 黄芩苷可阻断TLR4-AP-1-VEGF的激活，从而抑制胃癌BGC-823、MGC-803细胞的迁移。

关键词：脂多糖；Toll样受体；黄芩苷；迁移；胃癌

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0064-05

炎症与肿瘤关系密切，慢性炎症与25%以上癌症的发生相关，参与肿瘤的发生、发展，促进肿瘤的侵袭与转移[1]。胃癌的发生与慢性炎症密切相关，“Hp感染-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-胃癌”是典型的炎症与癌症相关的例子。寻找一种既抗炎又抗肿瘤的药物是抗肿瘤研究的重要方向。黄芩苷是唇形科

植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。研究表明，黄芩苷有抗肿瘤[2]、抑菌抗炎[3]等药理作用。脂多糖（LPS）是Toll样受体（TLR）的外源性配体，能激活TLR的核因子（NF）-κB及激活蛋白-1（AP-1）等信号通路，引起多种细胞的炎症反应[4]。本实验采用LPS干预胃癌BGC-823、MGC-803细胞激活TLR，观察LPS对胃癌细胞转移能力的影响，并用黄芩苷加以干预，观察黄芩苷对胃癌细胞侵袭转移能力的影响，初步探讨其可能的作用机制，为黄芩苷治疗炎症相关性肿瘤提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞株

胃癌MGC-803、BGC-823细胞，中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 药物与试剂

黄芩苷，南京狄尔格医疗器械有限公司，CAS号21967-41-9。高糖DMED培养基，健顺生物公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；Maker和Transwell小室，Thermo scientific公司；反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒，大连宝生物公司，引物均由大连宝生物公司合成；一抗TLR4、AP-1、血管内皮生长因子（VEGF）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）购自Affinity公司，二抗购自碧云天公司。

1.3 主要仪器

光学显微镜（日本Nikon公司），超净工作台（苏静安泰），CO2培养箱（Thermo公司），微量移液枪（日本立洋），TGL-16G离心机（上海医疗器械七厂），低温离心机（Beckman公司），电泳仪（北京六一仪器厂），微量上样器（上海生工生物工程有限公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

用含10%FBS高糖DMEM，加青霉素、链霉素（100 U/mL），37 ℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养胃癌MGC-803、BGC-823细胞。每隔2 d换完全培养基，待细胞密度达90%时按1∶2比例传代。取对数生长期细胞用于下一步实验。

2.2 划痕实验

将对数生长期细胞接种于预先底部画线的6孔板，待细胞贴壁生长至满，用10 μL无菌枪头垂直于底部划线性划痕，PBS漂洗3次去除脱落细胞，再用无血清培养液[分为对照组（只加培养液）、LPS组（1、10、100、1000、10 000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组]干预，继续培养。划痕后0、12、24、36 h随机选择划痕区3个视野拍照，比较各组间划痕愈合的差异，用愈合率代表细胞迁移能力。计算细胞愈合率[（愈合前细胞间空白区域面积-愈合后细胞间空白区域面积）÷愈合前细胞间空白区域面积×100%]。

2.3 Transwell小室实验

将对数生长期细胞饥饿12 h后，按5×105个/mL细胞的密度接种于24孔培养板内的Transwell小室中，置于培养箱中继续培养至细胞贴壁后，吸出小室中培养液，换新的无血清培养基[分为对照组（只加培养液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组]继续培养，在下室中加600 μL含25%FBS的DMEM细胞培养液，培养箱中培养24 h，经PBS洗涤，甲醛固定，甲醇渗透，结晶紫染色后镜下选3个视野拍照计数，取其平均值，以穿过小室细胞数代表细胞的迁移能力。

2.4 RT-qPCR检测

将对数生长期胃癌MGC-803、BGC-823细胞分为对照组（只加培养液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组，干预24 h，提取各组总RNA，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃反转录成cDNA；95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，65 ℃、30 s，经过40个循环，cDNA扩增，检测TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达。PCR反应结束后分析融解曲线，从而判定扩增产物是否有非特异性扩增；分析扩增曲线，计算Ct值，采用2?ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

2.5 Western blot检测

将对数生长期胃癌MGC-803、BGC-823细胞分为对照组（只加培养液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷（40 μmol/L）+LPS（1000 ng/mL）组干预24 h，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取总蛋白，将蛋白煮沸变性后，经12%SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗（TLR4、AP-1、VEGF、GAPDH）孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL于Bio-rad凝胶成像仪中进行反应，采用Image J软件对Western blot结果进行定量分析，灰度值以累积吸光度值表示，结果以目的蛋白与GAPDH累积吸光度的比值表示。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计意义。

4 结果

4.1 划痕实验黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移能力的影响

与对照组比较，LPS组划痕愈合程度明显高于对照组，并随浓度的增大，愈合程度也逐渐增强，其中，1000 ng/mL LPS组愈合程度最强，24 h时效果最明显，见图1、图2。根据以上结果，选用1000 ng/mL LPS作为LPS组。根据前期实验MTT结果，选用40 μmol/L黄芩苷干预作为黄芩组。继续用划痕实验观察黄芩苷对LPS干预后2株胃癌细胞迁移能力的影响，结果发现LPS+黄芩苷组较LPS组愈合程度慢，差异有统计意义（P<0.01），见图3、图4。

4.2 Transwell实验黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移能力的影响

选用1000 ng/mL LPS作为LPS组，选用40 μmol/L黄芩苷干预作为黄芩苷组，继续用Transwell实验观察黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移能力的影响。与对照组比较，LPS组2株细胞穿过小室细胞数较多（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组穿过小室细胞数较少（P<0.01），见图5、图6。

4.3 黄芩苷对Toll样受体4、激活蛋白-1、血管内皮生长因子基因表达的影响

与对照组比较，LPS组TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达明显降低（P<0.01）。结果见图7、图8。

4.4 黄芩苷对Toll样受体4、激活蛋白-1、血管内皮生长因子蛋白表达的影响

与对照组比较，LPS组TLR4、AP-1、VEGF蛋白表达明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组TLR4、AP-1、VEGF蛋白表达显著降低（P<0.01）。结果见图9、图10。

5 讨论

近年来大量的实验表明，炎症不仅与肿瘤的发生密切相关，与肿瘤转移也密切相关，在这个领域目前已取得一些初步成果，如versican-TLR2-TNFα、RANKL-RANK-IKKFα-Maspin通路等[5]。

目前中药成分抗肿瘤的研究已成为热点。杜氏等[6]报道雷公藤红素抑制HepG2细胞的迁移，朱氏等[7]研究痰瘀同治方药物血清有影响人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的作用。我们的前期实验也发现，黄芩苷可通过死亡受体通路诱导胃癌细胞凋亡。同时有研究发现黄芩苷可抑制结肠癌细胞的迁移[8]。

LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，在慢性炎性反应过程中发挥重要作用。本实验目的在于用LPS营造一个肿瘤的炎性微环境，观察LPS是否促进胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移以及黄芩苷是否抑制炎性微环境胃癌细胞的迁移。本研究通过划痕实验及Transwell小室实验证实了LPS可促进以上2株胃癌细胞的迁移，且发现黄芩苷可抑制LPS干预的胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移。研究发现，LPS与TLR4结合后可诱导肺癌细胞产生转化生长因子、VEGF及白细胞介素-8，同时LPS可使肺癌细胞的VEGF表达升高，促进肺癌细胞的转移[9]。本研究结果也证实了这一点。

Qian等[10]研究显示，LPS可激活膀胱癌细胞的TLR4 信号转导通路，激活MAPK。Ouyang等[11]进一步研究表明，MAPK可激活AP-1，AP-1以由c-Jun、c-Fos和亮氨酸拉链结构域形成的异源二聚体的形式存在于细胞中，在肿瘤的发生和演进过程中起关键性的调节作用，且VEGF基因启动子中含有多个AP-1结合位点，活化的AP-1可以通过VEGF促使肿瘤细胞侵袭与转移。因此，可以认为LPS激活肿瘤细胞的TLR4信号转导通路，激活MAPK，从而激活AP-1，最终激活VEGF，导致肿瘤细胞的转移。

Feng等[12]研究显示，黄芩苷可下调TLR4表达。本研究发现，LPS干预的2株胃癌细胞TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达均明显升高，而黄芩苷可下调LPS干预后的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达。由此可以认为，黄芩苷可能通过抑制LPS与TLR4的结合，从而抑制MAPK激活AP-1，抑制VEGF表达，进而抑制2株胃癌细胞的迁移。

本实验只观察LPS及黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞迁移的影响及可能的作用机制，其对2株胃癌细胞侵袭的影响尚未可知，需进行更多的实验观察验证。

参考文献：

[1] 夏娟，李冬，郑伟萍，等.炎症与肿瘤的关系研究进展[J].国际检验医学杂志，2013，34（1）：63-65.

[2] ZHENG J， HU J D， CHEN Y Y， et al. Baicalin induces apoptosis in leukemia hl-60/ADR cells via possible down-regulation of the PI3K/Akt signaling pathway[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention：APJCP，2012，13（4）：1119-1124.

[3] LUO W， WANG C Y， JIN L. Baicalin downregulates porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide upregulated IL-6 and IL-8 expression in human oral keratinocytes by negative regulation of TLR signaling[J]. PLoS One，2012，7（12）：51008.

[4] 朱晓静，张峰，孔德松，等.脂多糖/toll样受体4信号转导与肝纤维化的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2013，27（1）：106-109.

[5] 吉登波，崔景荣.肿瘤的发生、发展及治疗与炎症的关系[J].中国新药杂志，2010，19（17）：1551-1555.

[6] 杜娜，付建华，李健，等.雷公藤红素对HepG2细胞迁移的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（7）：51-54

[7] 朱盛，刘建勋.痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：50-55.

[8] 吴汪泽，王卉，卢忠心.黄芩苷对结肠癌细胞迁移与侵袭能力的抑制作用及其机制研究[J].现代预防医学，2016，43（4）：708-710，726.

[9] HE W， LIU Q， WANG L， et al. Tlr4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance[J]. Molecular immunology， 2007，44（11）：2850-2859.

[10] QIAN Y， DENG J， XIE H， et al. Regulation of Tlr4-induced IL-6 response in bladder cancer cells by opposing actions of MAPK and PI3K signaling[J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，2009，135（3）：379-386.

[11] OUYANG X， JESSEN W J， Al-Ahmadie H， et al. Activator protein-1 transcription factors are associated with progression and recurrence of prostate cancer[J]. Cancer research，2008，68（7）：2132-2144.

[12] FENG J， GUO C， ZHU Y， et al. Baicalin down regulates the expression of TLR4 and NFκB-p65 in colon tissue in mice with colitis induced by dextran sulfate sodium[J]. International Journal of Clinical and Experimental Medicine，2014，7（11）：4063.