健脾化湿颗粒对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠5-羟色胺、5-羟色胺3受体的影响

靳继伟　王迎寒　张晓峰　杜海燕　郭洪杰

(承德医学院,河北　承德　067000)



健脾化湿颗粒对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠5-羟色胺、5-羟色胺3受体的影响

靳继伟王迎寒张晓峰杜海燕郭洪杰

(承德医学院,河北承德067000)

目的探讨健脾化湿颗粒对腹泻型肠易激综合征(D-IBS)模型大鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)和5-羟色胺3受体(5-HT3R)水平的影响。方法选用60只SD雄性大鼠，按体重随机分成六组，分别为正常组，模型组，健脾化湿颗粒低、中、高剂量组，阳性对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠结肠黏膜中5-HT含量，采用免疫组化法检测结肠黏膜下5-HT3R阳性细胞的表达量，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测结肠中5-HT3R mRNA的表达水平。结果与正常组相比，模型组结肠中5-HT水平显著升高(P<0.05)，结肠黏膜下层5-HT3R阳性细胞的含量明显升高(P<0.05)，结肠中5-HT3R mRNA的表达水平亦显著升高(P<0.05)；健脾化湿颗粒可以降低5-HT水平，5-HT3R水平及其mRNA表达量。结论健脾化湿颗粒可能通过降低结肠黏膜5-HT含量，减少结肠5-HT3R的表达量，减弱5-HT3R神经元兴奋性，从而改善内脏痛觉敏感状态，消除肠道反应。

腹泻型肠易激综合征;5-羟色胺;5-羟色胺3受体

肠易激综合征(IBS)是一种常见的胃肠道功能紊乱性疾病，常常表现为腹痛、腹胀、排便和大便性状异常，预后良好不危及生命，但是长期反复发作可以明显降低患者的生活质量。目前认为IBS的发病机制主要是内脏高敏感和胃肠动力异常〔1〕。根据粪便性状，IBS可以分为腹泻型、便秘型、腹泻-便秘交替型〔2〕。腹泻型肠易激综合征(D-IBS)患者以腹痛、腹泻为主，并同时伴有心烦、抑郁、焦虑等神经功能失调症状，是临床上常见的胃肠道功能性疾病。本实验通过检测结肠5-羟色胺(5-HT)及5-HT3受体(5-HT3R)的含量变化探讨健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠5-HT信号系统的作用机制。

1　材料与方法

1.1动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供的同批无特定病原体(SPF)清洁级雄性SD大鼠60只，体重为(250±10)g。

1.2药品番泻叶(安国市昌达中药材饮片有限公司，批号1009002)，用水煎煮 2次后浓缩为含生药量0.3 g/ml的药液；阳性对照药为得舒特(法国苏维特公司，批号627414)，用蒸馏水配制成为3 mg/ml的溶液；健脾化湿颗粒，由炙黄芪、益智仁、炒白术等共10味中药制成。

1.3仪器试剂SORVALL Biofuge fresco冷冻离心机(德国Kendro Labrotary公司)；DU800紫外可见分光光度计(美国CKMAN COULTER公司)；美国Biorad icycler PCR仪(icycler)；DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；5-HT酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit(大连宝生物工程有限公司)；引物合成(上海英潍捷基贸易有限公司)；各引物序列：β-actin正义链5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反义链5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'，长度452 bp；5-HT3R正义链5'-ATCAATGAGTTTGTGGACGTGG-3'，5-HT3R反义链5'-GCGGATGACCACGTAGAACT-3'，354 bp。DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；SP免疫组织化学试剂盒(北京四正柏生物技术有限公司)；

1.4分组与造模方法将60只SD雄性大鼠按照体重随机分成六组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、健脾化湿颗粒低、中、高剂量组，每组10只。实验前禁食不禁水，除正常组外其余各组大鼠前2 w分别予以番泻叶煎剂灌胃。后2 w在灌服完番泻叶煎剂后用透明胶带束缚大鼠前上肢，胸部及肩部持续2 h。2 h后模型组予以生理盐水灌胃；健脾化湿颗粒低、中、高剂量组予以健脾化湿颗粒0.25、0.5、1 g/ml剂量灌胃；阳性对照组予以得舒特(3 mg/ml)灌胃；正常组全程只予以生理盐水灌胃，以上灌胃剂量均按10 ml/kg。末次给药后处死大鼠，取距离肛门处约5～6 cm结肠，用生理盐水清洗干净，之后一部分置于-80℃冰箱里冷冻保存，用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)；一部分多聚甲醛固定用于免疫组化。

1.5ELISA检测大鼠结肠中5-HT含量取储存于-80℃冰箱结肠，用ELISA法测定结肠中5-HT水平。操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.6免疫组化法检测结肠黏膜下层5-HT3R阳性细胞表达量取经过多聚甲醛固定的结肠组织，石蜡包埋后切片进行免疫组化染色实验。操作步骤严格按照SP免疫组化试剂盒说明书进行，应用二氨基联苯胺(DAB)显色，其中以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照。以胞质中出现棕黄色反应物视为阳性反应，阴性对照组无棕黄色反应物。采用IPP图像分析软件对5-HT3R的表达进行半定量分析。每例随机选取 6个400×视野的平均光密度值作为测量值，其值越大则染色越强。

1.7RT-PCR法检测大鼠结肠中5-HT3R mRNA水平取储存于-80℃冰箱中结肠组织，用于提取RNA。①采用Trizol一步法从大鼠结肠中提取总RNA，加入无酶水充分溶解。②将上述稀释适当倍数后的RNA经DU800紫外可见分光光度计测出稀释后的RNA浓度，再计算出RNA总浓度cRNA。③按照总RNA上样量为2 μg配制成20 μl体系充分混匀，反转录成cDNA。④在PCR仪中进行扩增,以β-actin作为内参照。

1.8统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析中的LSD检验及Dunnettt检验。

2　结　果

2.1健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠结肠5-HT的影响与正常组相比，模型组5-HT水平明显升高〔(1.9±0.2)vs(0.9±0.1)ng/ml，P<0.05〕；与模型组比较，健脾化湿颗粒低〔(1.7±0.1)ng/ml〕、中〔(1.3±0.2)ng/ml〕、高剂量组〔(1.1±0.1)ng/ml〕以及阳性对照组5-HT水平均降低〔(1.5±0.2)ng/ml，P<0.05〕；与阳性对照组比较，健脾化湿颗粒低剂量组5-HT水平升高(P<0.05)。健脾化湿颗粒中、高剂量组5-HT水平降低，其中健脾化湿颗粒高剂量组5-HT水平降低作用最为显著(P<0.05)。

2.2健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠结肠黏膜下层5-HT3R阳性表达的影响与正常组比较，模型组5-HT3R阳性表达水平明显增多(0.264±0.013 vs 0.126±0.010,P<0.05)。与模型组比较，健脾化湿颗粒低、中、高剂量组(0.226±0.013、0.170±0.008、0.137±0.008)以及阳性对照组5-HT3R阳性表达水平均降低〔(0.178±0.014)，P<0.05〕；与阳性对照组比较，健脾化湿颗粒低剂量组5-HT3R阳性表达水平升高(P<0.05)；健脾化湿颗粒中剂量组与之作用相似(P>0.05)；健脾化湿颗粒高剂量组5-HT3R阳性表达水平显著下降(P<0.05)。见图1。

2.3健脾化湿颗粒对D-IBS大鼠结肠5-HT3R mRNA表达水平的影响见图2。与正常组比较，模型组5-HT3R mRNA水平明显升高(0.736±0.063 vs 0.254±0.041,P<0.05)。与模型组比较，健脾化湿颗粒中、高剂量组5-HT3R mRNA水平降低(0.549±0.078，0.355±0.022，P<0.05)，健脾化湿颗粒低剂量组5-HT3R mRNA水平无明显变化(0.695±0.068，P>0.05)；与阳性对照组(0.627±0.049)比较，健脾化湿颗粒高剂量组5-HT3R mRNA水平明显降低(P<0.05)。

图1　健脾化湿颗粒对大鼠结肠黏膜5-HT3R表达的影响(DAB，×400)

1～6：正常组，模型组，阳性对照组，健脾化湿颗粒低、中、高剂量组图2　健脾化湿颗粒对大鼠结肠5-HT3R mRNA表达水平的影响

3　讨　论

现代医学认为IBS发病原因可能与基因、感染、肠黏膜屏障功能紊乱、脑肠轴功能异常等多种因素有关，近年来随着精神胃肠疾病学的发展，认为脑-肠轴功能紊乱是导致IBS的主要病机之一，5-HT作为重要的脑肠神经递质，具有多种生物学功能,参与了胃肠运动，摄食、睡眠、情绪、认知等多种生理功能的调控。在生理状态下，肠嗜铬(EC)细胞能自发的向固有层和肠腔内释放一定量的5-HT，而各种肠道刺激均能通过刺激EC细胞释放大量额外的5-HT,有学者曾提出EC细胞分泌的5-HT与神经系统和胃肠道感觉运动〔3〕存在不同程度的相关性。有研究〔4〕显示D-IBS患者的5-HT释放量增加,通过对D-IBS患者血液中5-HT浓度的测定发现其明显高于对照组。推测5-HT释放量增加与IBS密切相关的原因可能是：一方面可能导致内脏传入神经和肠神经系统的敏感性增高，激活多种有关的神经活性物质，使其参与脑-肠调节的化学信号异常；另一方面 5-HT 与肠黏膜上皮、黏膜下或肌间神经丛的 5-HT 受体相结合，在胃肠道运动、内脏高敏感等方面发挥着重要作用。5-HT受体比较复杂，目前已知5-HT受体分为7个家族即5-HT1-7R，14个亚型〔5〕，主要分为两大类，分别是配体门控离子通道受体和G蛋白耦联受体。其中5-HT3R和5-HT4R与胃肠道感觉和运动最为密切。5-HT通过与5-HT受体结合调节分泌、吸收、胃肠运动及感觉等复杂功能，形成一系列排便异常等IBS典型症状。其中5-HT3R是唯一的一种非G蛋白耦联受体，在黏膜下神经丛和肠肌间神经丛均有表达。5-HT3R激活后可以产生一系列效应，包括细胞膜去极化以及增加细胞内Ca2+浓度，使中枢和外周神经元兴奋，调节神经递质的释放,进一步使副交感神经末梢释放乙酰胆碱(Ach)增多，从而导致内脏高敏感性和腹部不适等胃肠道功能异常。研究表明5-HT3R在D-IBS模型中的表达明显高于空白对照组〔3〕。此过程可被5-HT3受体拮抗剂所抑制，此机制可能通过增加肠道顺应性，提高其痛阈水平并增加小肠对水、电解质的吸收而达到有效缓解腹胀、腹痛、便急等症状。5-HT3受体调节剂主要是5-HT3受体拮抗剂，多应用于D-IBS，代表性药物包括昂丹司琼、阿洛司琼等。 综上所述，5-HT作为重要的神经递质和信号分子，在参与和调节胃肠道功能中通过自身调节或与多种受体作用参与了IBS胃肠动力异常和内脏高敏感性，5-HT信号系统在IBS发病机制中起着至关重要的作用。

中医学理论依据临床表现将D-IBS归属于“腹痛”、“泄泻”范畴，认为本病的病机为肝郁脾虚，脾脏在损伤的情况下，易为情志所伤导致肝木乘脾，可使脾气健运，气机升降失常，导致本病发生。健脾化湿汤源于上海著名中医马贵同教授的经验方，已有三十多年的临床应用基础，共有10味药组成，方中炙黄芪益脾气、升清阳，益智仁温补脾肾、固涩止泻，二者共为君药。炒白术、茯苓助黄芪健脾益气，兼能化湿，为健脾培土之重臣；砂仁化湿行气、温中止泻，乌药温肾散寒、行气止痛，既助益智仁温肾止泻，又通畅湿邪所阻之气机；四者为臣药。陈皮理气燥湿，炒白芍柔肝调气，防风香燥胜湿，炙甘草健脾益气，调和诸药，四者共为佐使。诸药配合紧密，共奏理气健脾、化湿止泻之奇效，适用于D-IBS。

本实验结果显示，与正常组比较，建模成功后大鼠明显出现腹泻，急躁易怒，体重降低，大鼠肠道指数变化率增加，内脏敏感性降低等症状，与临床中D-IBS患者症状极其相似,健脾化湿颗粒可以改善D-IBS大鼠此等症状，其作用机制可能与降低中枢5-HT水平有关。本实验结果提示健脾化湿颗粒可能通过降低大鼠结肠黏膜5-HT和5-HT3R水平进而减弱神经元兴奋性，升高内脏痛阈水平，从而消除肠道反应。然而D-IBS发病机制十分复杂，无法用单一的生理病理知识解释其复杂的症状，同样健脾化湿颗粒在改善D-IBS症状的作用机制也不是单一的，在今后的研究中尚需从多个角度进一步探讨健脾化湿颗粒在治疗D-IBS中的作用机制。

1Kanazawa M,Hongo M,Fukudo S.Visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2011;26(Suppl 3):119-21.

2Moore NA,Sargent BJ,Manning DD,etal.Partial agonism of 5-HT3 receptors:a novel approach to the symptomatic treatment of IBS-D〔J〕.ACS Chem Neurosci，2013;4(1):43-7.

3Gershon MD,Tack J.The serotonin signaling system:from basic understanding to drug development for functional GI disorders〔J〕.Gastroenterology,2007;132(1):397-414.

4Cremon C,Carini G,Wang B,etal.Intestinal serotonin release,sensory neuron activation,and abdominal pain in irritable bowel syndrome〔J〕.Am J Gastroenterol,2011;106(7):1290.

5Chiba T,Yamamoto K,Sato S,etal.Long-term efficacy and safety of ramosetron in the treatment of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome〔J〕.Clin Exp Gastroenterol,2013;6:123-8.

〔2014-12-09修回〕

(编辑冯超/曹梦园)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.004

河北省高等学校科学技术研究项目(No.10276105D-45)

郭洪杰(1962-)，男，博士，副主任医师，主要从事中医内科学研究。

靳继伟(1990-)，女，硕士，主要从事中药药理学研究。

R442.2

A

1005-9202(2016)14-3357-03；