中药多糖对免疫抑制小鼠T细胞亚群影响的差异研究*

罗　霞，胡明华，马方励，温如燕，郑彦懿，周　联



中药多糖对免疫抑制小鼠T细胞亚群影响的差异研究*

罗霞，胡明华，马方励，温如燕，郑彦懿，周联*

目的比较巴戟天多糖（BJT）、酒黄精多糖（JHJ）、淫羊藿多糖（YYH）、人参多糖（RS）、黄芪多糖（HQ）、何首乌多糖（HSW）、生地多糖（SD）、枸杞多糖（GQ）对免疫抑制小鼠T细胞亚型影响的差异。方法采用环磷酰胺腹腔注射制成免疫抑制小鼠模型，通过流式细胞技术（flow cytometry，FCM）检测T细胞比例及分型。结果给予环磷酰胺后，与正常组比小鼠外周血中CD3+T细胞比值明显升高（P＜0.01），YYH，高剂量HQ，低、高剂量RS、HSW、SD、GQ多糖对CD3+T细胞比值具有恢复作用（P＜0.05）；多糖对环磷酰胺所致Th1/Th2平衡失调具有恢复作用，其中YYH低剂量组，RS、HQ、JHJ、GQ低、高剂量组，HSW、SD高剂量组与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而JHJ、GQ低、高剂量，HSW、SD高剂量多糖对Th2的影响较明显；此外，低、高剂量BJT、YYH、RS、GQ多糖对环磷酰胺所致Treg比例减少有恢复作用，与模型相比差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论补益类中草药多糖具有调节免疫系统平衡的作用，在这一过程中，性味不同中药来源的多糖可能通过作用于不同的免疫细胞起作用，滋补阴血中药的多糖免疫调节活性主要偏向于Th2细胞，温补阳气中药的多糖对Treg细胞作用较明显。

中药多糖；免疫抑制；T细胞亚群

［Abstract］ObjectiveTo compare the differences of morinda polysaccharide（BJT），wine sibiricum（JHJ），epimedium（YYH），ginseng polysaccharides（RS），astragalus polysaccharide（HQ），polygonum polysaccharide（HSW），habitatpolysaccharide（SD），andlyciumbarbarumpolysaccharide（GQ）inaffectingonTcellsubsetin immunosuppressed mouse.MethodsImmunosuppressed mice model was made by intraperitoneal injection of cyclophosphamide，the ratio and subtype of T cell were detected by flow cytometry（FCM）.ResultsAfter administration of cyclophosphamide，the ratio of CD3 cells in peripheral blood in mice was significantly higher（P＜0.01）；compared with the control group，low dose of YYH，high dose of HQ，low and high dose polysaccharide of RS，HSW，SD，GQ had a recovery ratio effect on CD3 cell（P＜0.05）；polysaccharides had recovery ratio effect on Th1/Th2 imbalance induced bycyclophosphamide，which the difference was statistically significant in low and high dose polysaccharide of YYH，RS，HQ，JHJ，GQ，high dose polysaccharide of HSW，SD compared with the model（P＜0.05）；however，low and high dose polysaccharide of JHJ，GQ，high dose polysaccharide of HSW，SD had an obvious effect on Th2；in addition，low and high dose polysaccharide of BJT，YYH，RS，GQ had a recovery ratio effect on Treg induced by cyclophosphamide，compared with the model group，the difference was statistically significant（P＜0.05，or P＜0.01）.ConclusionTonic Chinese herb polysaccharides have effect of regulating the balance of immune system，in this process，the function of polysaccharide derived from Chinese medicine with differentproperties and taste reflected in effecting on difference immune cell，and the immunoregulatory activity of polysaccharides derived from Chinese medicine with nourishing Yin and blood is mainly related to Th2 cells，in addition，the polysaccharides derived from Chinese medicine with warming Yang-qi have obvious effect on Treg cell.

［Key words］Polysaccharide；Immunosuppress；T-cell subset

性味是中药的重要属性和用药基础，基于中药多糖HPLC图谱的寒热属性分析发现［1］，中药多糖成分与其寒热药性存在相关性，中药多糖成分在一定程度上可以反映其性味。多糖不仅参与细胞的生命活动，也是机体的结构物质。作为中药的主要活性成分之一，在中药发挥调节免疫功能方面尤为重要。由此衍生出来的抗肿瘤、抗炎、抗病毒，以及抗氧化等药理作用中，不同中药提取的多糖不尽相同［2，3］。此外，也发现部分多糖的免疫抑制作用［4］。由此可见，中药多糖生物学活性的差异与其来源有关。鉴于此，本研究选择了部分滋阴和补阳中药提取的多糖，通过免疫抑制小鼠模型，观察不同性味来源中药的多糖成分对T细胞亚群的影响，以探究不同中药性味在免疫活性上的差异。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组SPF级BALB/c小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供。随机分为：空白对照组；免疫抑制模型组；巴戟天多糖低、高（BJTL、BJTH）剂量组；酒黄精多糖低、高（JHJL、JHJH）剂量组；淫羊藿多糖低、高（YYHL、YYHH）剂量组；人参多糖低、高（RSL、RSH）剂量组；黄芪多糖低、高（HQL、HQH）剂量组；何首乌多糖低、高（HSWL、HSWH）剂量组；生地多糖低、高（SDL、SDH）剂量组；枸杞多糖低、高（GQL、GQH）剂量组。以上各组每组动物10只。

1.2主要试剂及仪器环磷酰胺：山西普德药业股份有限公司，批号04131204；CD3-FITC：Biolegend公司产品，批号B172735；CD4-PE：BioLegend公司产品，批号B180856；CD8a-PEcy5：BioLegend公司产品，批号B187949；CD69-PE：eBioscience公司产品，批号：E01331-1631。IL-4-PE：Biolegend公司产品，批号：B172983。INF-γ-FITC：Biolegend公司产品，批号：B162926。Treg&kit：eBioscience公司产品，批号E09666-1646。MCO-20AIC型二氧化碳培养箱：日本SANYO公司；酶标仪：美国THERMO公司；FACSCantoⅡ型流式细胞仪：美国BD公司。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制作免疫抑制小鼠模型采用腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，连续2 d，并于末次注射给药后第5天测定指标。以成人口服的等效剂量为低剂量（表1），等效剂量的2倍为高剂量，每天按0.2 ml/10 g体重灌胃给药1次，连续20 d，空白对照组给予等体积蒸馏水。

1.3.2不同多糖对CD3+、CD4+、CD8+T细胞的影响摘眼球取小鼠眼眶静脉血于肝素钠抗凝管中摇匀，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度106个/ml，分别加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PEcy5染色后于流式细胞仪检测。

1.3.3不同多糖对Th1、Th2及其比例的影响摘眼球取小鼠眼眶静脉血于肝素钠抗凝管中摇匀，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为2× 106/ml，按200 μl/孔接种于96孔版。加入8 μl（25×）PMA/Ionomycin混合液，振荡混匀后，于37℃，5%CO2培养箱中孵育4 h。孵育完成后用PBS洗细胞，去上清后，用剩余PBS重悬，将其中一样品管分为A、B，将B管作为样品管的同型对照管。每管加入100 μl Fix&Perm中的Reagent A（固定液），混匀，室温避光孵育15 min。加2 ml PBS，300 g，4℃，离心10 min去上清后，用剩余PBS重悬，加入100 μl Fix&Perm中的Reagent B（破膜液），同时破膜质控管加入Anti-mouse CD69-PE，样品同型对照管加入Mouse IgG1κIsotype Control-FITC，其余样品管加入Anti-mouse INF-γ-FITC以及Anti-mouse IL-4-PE。室温避光孵育40 min。加2 ml PBS，300 g，4℃，离心10 min上清，各加入400 μl PBS重悬，上机检测。

1.3.4不同多糖对调节性T细胞（regulatory T，Treg）的影响摘眼球取小鼠眼眶静脉血于肝素钠抗凝管中摇匀，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。取制备好的100 μl细胞悬液于流式管中，加入Anti-mouse CD4-FITC和Anti-mouse CD25-APC。4℃孵育30 min。加入2 ml预冷的PBS重悬，300 g，4℃，离心10 min。去上清，重悬细胞后加入1 ml新鲜配制的固定/破膜工作液，并再次旋涡混匀。室温避光孵育30 min后，加入2 ml破膜缓冲液工作液，300 g，4℃，离心10 min。去上清液，用剩余液轻轻振荡后，加入Anti-mouse Foxp3-PE，同型对照管加Anti-mouse Rat lgG2a-PE，室温避光孵育30 min。加入2 ml破膜缓冲工作液洗涤细胞，离心后弃去上清，加200 μl Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，上机检测并分析。

1.4统计学分析数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.18种多糖对免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影响给予环磷酰胺后，小鼠外周血中CD3+细胞比值明显升高，与文献报道一致［5］；与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。在此模型基础上，给予供试多糖，CD3+细胞比值升高，其中YYHL、RSLH、HQH、HSWLH、SDLH、GQLH与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，环磷酰胺对小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞比例及其比值没有显著影响，给予不同多糖后，也没有明显变化（表1）。

2.28种多糖对免疫抑制小鼠Th1、Th2的影响给予环磷酰胺后，小鼠外周血中Th1/Th2细胞比值明显降低，表现为向Th2漂移，Th1/Th2细胞平衡被打破，与文献报道一致［6］。这一差异与空白对照组比较有极显著的统计学意义（P＜0.01）。在此模型基础上，给予供试多糖，Th1/Th2细胞比值升高，二者的平衡在各多糖组均有不同程度地恢复，其中YYHH、RSLH、HQLH、JHJLH、HSWH、SDH、GQLH与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，或P＜0.01）。进一步比较发现，相对Th1细胞而言，JHJLH、HSWH、SDH、GQLH对Th2的影响更为显著，而YYHH、RSLH、HQLH则对Th1、Th2的影响没有明显区别（表2）。

表1　8种多糖对免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影响（x±s，n=8）

表2　8种多糖对免疫抑制小鼠Th1、Th2的影响（±s，n=8）

表2　8种多糖对免疫抑制小鼠Th1、Th2的影响（±s，n=8）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01。

组别剂量（mg/kg）IFN-γ（%）IL-4（%）Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）空白对照等体积蒸馏水2.59±0.700.40±0.136.74±1.47模型等体积蒸馏水2.64±0.600.55±0.16△4.90±0.67▲BJTL801.73±0.21#0.33±0.01*5.42±1.27 BJTH1601.50±0.51#0.32±0.13#5.25±2.09 YYHL501.52±0.23*0.30±0.10*5.53±2.10 YYHH1001.50±0.47*0.26±0.08*5.93±1.27*RSL1602.25±0.770.43±0.215.70±1.05*RSH3202.35±0.430.43±0.135.89±1.53*HQL1502.36±0.380.43±0.105.68±1.11*HQH3002.32±0.530.40±0.226.69±2.38*JHJL2001.65±0.89*0.29±0.15#5.23±2.14*JHJH4001.63±0.34*0.26±0.07#6.50±1.69#HSWL1602.46±0.710.46±0.175.61±0.99 HSWH3203.00±0.420.50±0.156.48±2.04*SDL2002.20±0.400.44±0.074.96±0.52 SDH4002.10±0.430.36±0.08*6.00±1.21*GQL1601.93±0.48*0.34±0.05#5.57±0.68*GQH3202.11±0.430.36±0.13*6.33±1.53*

2.38种多糖对免疫抑制小鼠Treg细胞的影响

给予环磷酰胺后，小鼠外周血中Treg细胞比值明显降低，这一差异与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01），与文献报道一致［7，8］。在此模型基础上，给予供试多糖后发现，Treg细胞比值升高，其中BJTLH、YYHLH、RSLH、GQLH与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，或P＜0.01）。见表3。

3　讨论

成熟的T细胞是一个复杂的异质性群体，根据其表面分子表达的差异可以分成不同的亚型。其中，根据CD分子表达不同可将成熟T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞；CD4+T细胞又可依据其产生细胞因子的不同又分为Th1和Th2细胞，以及Treg和Th17细胞等。T细胞不同的亚型的功能各异，正常情况下，机体各亚群数量处于动态平衡状态，一旦平衡被打破，可能引发疾病，这也是中药多糖调节免疫功能的物质基础［9，10］。与多糖免疫调节相关研究较多的亚群主要包括CD4+T、CD8+T、Th1、Th2以及Treg细胞等。

CD4+T细胞识别MHCⅡ类分子提呈的抗原肽，激活后通过分泌细胞因子发挥效应，起诱导和辅助作用；CD8+识别靶细胞表面抗原肽-MHCI类分子复合物，活化后具有直接杀伤效应。CD4+与CD8+T细胞亚群间的平衡，对维持机体的免疫功能至关重要。本实验中给予环磷酰胺后，T细胞比例明显升高，这与其作用机制有关。环磷酰胺以抑制B细胞为主，很自然地表现为T细胞比例的升高，由此并结合实验中小鼠的体重、脏器指数等（与空白对照组相比明显降低，数据未列出）变化可以看出，本实验环磷酰胺所致免疫抑制模型造模成功。环磷酰胺对CD4+T、CD8+T细胞的比例及其比值影响不大，给予多糖后，对T细胞比例均有的明显恢复作用，说明其对环磷酰胺所致的免疫抑制具有改善作用。

表38　种多糖对免疫抑制小鼠Treg细胞的影响（±s，n=8）

表38　种多糖对免疫抑制小鼠Treg细胞的影响（±s，n=8）

注：与空白对照组比较，▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

组别剂量（mg/kg）CD4+CD25+Foxp3+（%）空白对照等体积蒸馏水4.79±0.63模型等体积蒸馏水3.26±0.45▲BJTL804.33±0.83#BJTH1604.35±0.77#YYHL504.41±1.11*YYHH1004.34±0.89*RSL1604.43±0.67#RSH3204.44±0.64#HQL1503.57±0.75 HQH3003.40±0.44 JHJL2003.91±0.81 JHJH4003.46±0.82 HSWL1603.69±0.82 HSWH3203.27±0.49 SDL2003.57±0.58 SDH4003.93±0.54 GQL1604.61±0.77#GQH3203.71±0.36*

Th1细胞主要介导细胞免疫应答，促进细胞毒T细胞（CTL）的杀伤作用，激活巨噬细胞杀灭细胞内病原体（包括病毒和细菌）以及辅助B细胞产生与吞噬作用有关的抗体等，其功能亢进是引发器官特异性自身免疫疾病及急性排斥反应的重要原因［11］；Th2细胞主要参与体液免疫，抵御细胞外病原体和介导过敏反应，辅助IgG亚类转化为IgG1、IgE和IgA，负责非吞噬作用的宿主防御功能。Th1/Th2细胞的平衡状态是免疫功能的重要考察指标，两种细胞通过细胞因子作用的相互促进和制约使机体处于免疫应答的动态平衡，既能清除抗原性异物，又不至于损伤自身组织。本实验环磷酰胺导致免疫抑制时，其Th1/Th2平衡明显被打破，给予多糖后，小鼠外周血Th1/Th2平衡明显恢复，YYHH对Th1细胞较明显的作用，JHJLH、HSWH、SDH、GQLH对Th2细胞的作用显著。以上研究说明，不同中药来源的多糖在调节免疫平衡时对Th1、Th2细胞的作用有差异。

调节性T细胞具有免疫负调节功能，在维持自身耐受和避免罹患自身免疫性疾病中起着极其重要的作用。天然的调节性T细胞（即nTreg）主要表达CD4+、CD25以及其特征性标志Foxp3分子，通过这几种分子可以鉴定nTreg［12］。在环磷酰胺致免疫抑制小鼠模型中，其外周血Treg细胞明显减少，BJTLH、YYHLH、RSLH和GQLH对小鼠Treg细胞比例的明显恢复表明这些多糖有助于维持机体自身稳定。

多糖JHJ、HSW、SD、GQ来源于中药黄精、何首乌、生地、枸杞子，药性平和，均具有滋补阴血，扶正补虚的功效；多糖BJT、YYH、RS来源于中药巴戟天、淫羊藿、人参，药性甘温，均具有温补益阳气的功效。前者在恢复环磷酰胺免疫抑制小鼠Th1/Th2平衡的过程中，对Th2细胞的作用显著；后者对环磷酰胺所致Treg减少恢复明显。通过本次实验，结合多糖为中药性味主要的物质基础这一特点可以看出，这四味具有滋补阴血作用的中药来源的多糖免疫调节活性主要与其调节Th2细胞有关；另外四味相对于滋补阴血作用中药来源的多糖，具有温补阳气作用中药来源的多糖则偏重于对Treg细胞作用。然而本研究只从免疫平衡角度研究中药性味分类，仅仅是一个初步探讨，如若总结比较完善的规律，还需要进行更大样本量的研究。

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［本文编辑：刘一洋］

Different impacts of polysaccharides from Chinese materia medica on T－cell subsets in immuno-suppressed mice

LUO Xia①，HU Ming-hua，MA Fang-li，et al.①School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of TCM and Materia Medica，Guangzhou，Guangdong 510006，China

R284.1

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.019

广东省教育厅科研项目基金资助（2013LYM0014）

510006广东广州，广州中医药大学中药学院（罗霞，温如燕，郑彦懿，周联）；510623广东广州，无限极（中国）有限公司（胡明华，马方励）

周联，Email：zl@gzucm.edu.cn