不同品系栝楼果皮腺嘌呤和鸟苷含量比较

于京平，张永清.滨州医学院，山东 烟台 64003；.山东中医药大学，山东 济南 50355

不同品系栝楼果皮腺嘌呤和鸟苷含量比较

于京平1，张永清2
1.滨州医学院，山东 烟台 264003；2.山东中医药大学，山东 济南 250355

目的 比较不同品系栝楼果皮腺嘌呤、鸟苷含量，为选育良种和评价瓜蒌皮药材质量提供依据。方法 采用高效液相色谱法测定3个品系栝楼果皮中腺嘌呤、鸟苷的含量，色谱柱为Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 µm），流动相为甲醇-水，检测波长254 nm。结果 品系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ栝楼果皮腺嘌呤含量分别为0.159 4、0.159 6、0.134 1 mg/g，鸟苷含量分别为0.097 1、0.127 9、0.093 4 mg/g。结论 不同品系栝楼果皮鸟苷含量存在较大差异，以品系Ⅱ果皮中的腺嘌呤、鸟苷含量较高，提示选育良种是提高瓜蒌皮药材腺嘌呤、鸟苷含量的有效途径。

高效液相色谱法；栝楼；果皮；腺嘌呤；鸟苷

栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.为葫芦科多年生草质藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中药瓜蒌皮，可清热化痰、利气宽胸，具有调节脂代谢、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮、提高心肌抗缺氧能力、缺血再灌注损伤保护和钙拮抗等药理作用，用于治疗心、脑、肺等多脏器的多种疾病，尤以治疗动脉粥样硬化引起的缺血性疾病为著［1-2］。有关瓜蒌皮的活性成分至今不明确，2015年版《中华人民共和国药典》仅收载了以对照药材薄层定性的鉴别方法，控制瓜蒌皮药材质量尚缺乏合理指标。以瓜蒌皮为原料研制生产的瓜蒌皮注射液具有行气除满、开胸除痹功效，用于治疗冠心病心绞痛、脑梗死等［3-4］。腺嘌呤和鸟苷是瓜蒌皮注射液的主要成分，前者可提高红细胞携氧和放氧能力，与磷酸的结合物可刺激白细胞增生，用于防治白细胞减少症［5］；后者可改善心脑血液循环，具有防止心率失常、抗肿瘤、抗病毒等活性［6-7］。因此，在活性成分尚不明确的情况下，可以将腺嘌呤、鸟苷含量作为瓜蒌皮药材质量的控制指标。

山东省济南市长清区是瓜蒌的道地产区，种植历史悠久，药材质量上乘。由于栝楼属于雌雄异株植物，长期以来生产中种质混乱［8-9］。为了选育良种，实现提高产量、稳定质量的目标，我们经过广泛收集与比较，将当地栝楼种质资源划分为3个品系，并对不同品系果实与种子性状、果皮无机元素及挥发性物质等进行了分析测定［10-12］。本研究采用HPLC测定3个品系栝楼果皮中的腺嘌呤与鸟苷含量，旨在为栝楼良种选育和瓜蒌皮药材质量控制提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Agilent1200，美国Agilent），Waters AtlantisT3-C18色谱柱（4.6 mm×150.0 mm，5 µm），超声仪（KQ-300E，昆山市超声仪器有限公司），电子天平（FA1104，上海天平仪器厂）。

栝楼果皮样品采自济南市长清区马山镇北李村，经山东中医药大学张永清教授鉴定为葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥果皮。腺嘌呤对照品（批号050302，上海伯奥生物科技有限公司），鸟苷对照品（批号26-2006，上海中药标准化中心）；甲醇为色谱纯（美国Tedia公司）；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液 精密称取一定量减压干燥至恒重的鸟苷、腺嘌呤对照品，加水溶解，转移至20 mL容量瓶中，定容，混匀，配制成腺嘌呤、鸟苷浓度分别为0.029 4、0.070 4 mg/mL对照品溶液，用0.45 µm滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.1.2供试品溶液 将不同品系栝楼果皮置 55 ℃条件下烘干，粉碎，过四号筛。四分法取样，精密称定适量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10 mL，称定质量，50 ℃温浸1 h，50 ℃超声提取1 h（功率250 W，频率40 kHz），冷却，用15%甲醇补足减失的质量，4500 r/min离心10 min，取上清液，重复提取2次，合并上清液，用0.45 µm滤膜过滤，即得。

2.2色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters AtlantisT3-C18（4.6 mm×150.0 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温为室温；进样量：50 µL。色谱图见图1。

表1　流动相梯度洗脱程序（%）

2.3线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下鸟苷对照品溶液，分别加水稀释至25、10、8、5、4、2.5倍，摇匀，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，线性方程为Y=2 600 000X-1.218 7，r2=1.000 0。结果表明，鸟苷在0.148～1.408 µg范围内线性关系良好。

图1　混合对照品HPLC图

精密吸取“2.1.1”项下腺嘌呤对照品溶液，分别加水稀释至100、50、20、10、1倍，摇匀，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，线性方程为Y=5 000 000X+1.162 7，r2=0.999 7。结果表明，腺嘌呤在0.014 7～1.47 µg范围内线性关系良好。

2.4精密度试验

精密吸取对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，测定腺嘌呤、鸟苷峰面积，重复5次，其峰面积RSD分别为0.47%、0.70%，表明精密度良好。

2.5稳定性试验

精密吸取供试品溶液，在2、4、6、8、10 h内测定腺嘌呤、鸟苷峰面积5次，其峰面积RSD值分别为2.12%、3.12%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.6重复性试验

精密称取栝楼果皮样品，按“2.1.2”项下方法制备5份，分别测定腺嘌呤、鸟苷含量，均RSD＜2.00%，表明重复性良好。

2.7加样回收率试验

精密称量已知鸟苷、腺嘌呤含量的样品共6份，分别加入一定量的对照品，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件测定鸟苷、腺嘌呤含量，计算回收率，结果鸟苷、腺嘌呤的平均回收率分别为101.20%、100.67%，RSD分别为0.63%、0.91%，见表2、表3。表明对照品回收率符合要求。

2.8样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液50 µL，按上述色谱条件测定其峰面积积分值，以外标法计算鸟苷、腺嘌呤含量，重复3次。色谱图见图2，鸟苷、腺嘌呤色谱峰峰形较好，分离良好，保留时间分别为20.758、28.586 min。含量测定结果见表4。品系Ⅰ、Ⅱ栝楼果皮腺嘌呤含量相近，均显著高于品系Ⅲ；品系Ⅰ、Ⅲ栝楼果皮鸟苷含量相近，均显著低于品系Ⅱ。

表2　腺嘌呤加样回收率试验

表3　鸟苷加样回收率试验

表4　不同品系栝楼果皮腺嘌呤、鸟苷含量测定结果（mg/g）

图2　3个品系栝楼果皮鸟苷、腺嘌呤HPLC图

3 讨论

在检测波长的选择上，本试验对一定浓度的混合对照品溶液进行紫外扫描，结果254 nm为鸟苷的最大吸收波长，260 nm为腺嘌呤的最大吸收波长；与260 nm比较，波长254 nm检测时基线平稳、峰形较好，鸟苷具有较高的响应值，腺嘌呤响应值差距不大；因此选取254 nm作为检测波长。

本研究对超声提取和回流提取得到的2种供试品溶液进行HPLC测定，结果超声提取对栝蒌果皮中腺嘌呤、鸟苷的提取更为完全。超声提取适用于热稳定性较差、易高温破坏的核苷类成分提取，同时能够提高破碎速度，显著提高提取效率，平行操作性强。因此，初步选择超声提取作为瓜蒌皮药材核苷类成分HPLC含量测定的提取方式。

由于瓜蒌皮的活性成分至今尚不明确，其质量难以控制。本研究建立的HPLC方法，不仅能够使瓜蒌皮提取液中各组分达到有效分离，而且还能在同一色谱条件下同时测定腺嘌呤和鸟苷含量，为有效控制瓜蒌皮药材质量提供了新的途径和方法。测定结果显示，3个品系栝楼果皮鸟苷含量差异显著，以品系Ⅱ含量较高，提示可以通过良种选育来提高和保证瓜蒌皮药材的质量。虽然依据腺嘌呤和鸟苷含量可在一定程度上评价瓜蒌皮药材品质，但由于瓜蒌皮化学成分复杂，发挥临床疗效的成分种类可能有多种，因此，更加合理与完备的评价方法仍需深入研究。

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Comparison of Contents of Adenine and Guanosine in Peels of Three Strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.

YU Jing-ping1， ZHANG Yong-qing2（1. Binzhou Medical University， Yantai 264003， China； 2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Objective To compare the contents of guanosine and adenine in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.； To provide references for germplasm resources evaluation and breeding of the Chinese medicinal materials. Methods HPLC method was used to determine the contents of guanosine and adenine with Waters AtlantisT3-C18column （4.6 mm×150.0 mm， 5 µm）. The mobile phase was methanol and water， and the detection wavelength was 254 nm. Results The contents of guanosinein in peels of three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim. were 0.159 4， 0.159 6， 0.134 1 mg/g， respectively； the contents of adenine were 0.097 1， 0.127 9， 0.093 4 mg/g，respectively. Conclusion There were significient differences in the contents of adenine among three strains of Trichosanthes kirilowii Maxim.. Strain Ⅱ is with higher level of guanosine and adenine， which implies that the breeding of the Chinese medicinal materals is one way to improve the quality of Trichosanthis Exocarpium.

HPLC； Trichosanthes kirilowii Maxim.； peel； guanosine； adenine

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.021

R284.1

A

1005-5304（2016）09-0087-03

山东省科技发展计划（2008GG2NS02022）；山东省农业良种工程（2009LZ01-03）；济南市科技局高校院所自主创新项目（200906028）；滨州医学院科研启动基金项目（BY2014KYQD29）

2015-05-14；编辑：陈静）