呼伦贝尔草原野生牧草青贮中优良乳酸菌的分离及鉴定

王红梅，孙启忠，屠焰，司丙文，萨如拉，那亚，刁其玉*

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古 呼和浩特 010011)



呼伦贝尔草原野生牧草青贮中优良乳酸菌的分离及鉴定

王红梅1，孙启忠2，屠焰1，司丙文1，萨如拉2，那亚3，刁其玉1*

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古 呼和浩特 010011)

本研究对呼伦贝尔草原牧草青贮饲料中的乳酸菌进行了分离、鉴定，旨为筛选出优良乳酸菌菌株。以4个地区不同群落牧草的青贮饲料为试验材料，并采用传统微生物学鉴定方法及16S rRNA序列分析对分离得到的乳酸菌菌株进行了鉴定。菌株DME53为草乳杆菌，DMG108为干酪乳杆菌，DMC80为植物乳杆菌，DMG138为短乳杆菌，DMG139为戊糖片球菌；其中菌株DMG138为异型发酵乳酸菌，其余4株菌均为同型发酵乳酸菌。除DMG139在40和45 ℃下生长微弱外，其余菌株均在5～45 ℃不同温度条件下, 3.0%和6.5% NaCl培养液中良好生长。除菌株DME53在pH 3.0下不能生长外，其余菌株均在pH 3.0～8.0条件下良好生长或微弱生长。菌株DMC80具有产酸能力较强、发酵速率较快、耐酸、耐低温等特性，可作为制备适用于呼伦贝尔地区青贮饲料菌制剂的优良菌株。

乳酸菌；植物乳杆菌；青贮饲料；牧草；呼伦贝尔草原

呼伦贝尔草原是我国草原的重要组成部分之一，也是我国迄今植被保存较好，生物多样性丰富，区位优势显著，纬度最高，位置最北的一片天然草原[1]。其年温度差较大，冬季寒冷干燥，夏季炎热多雨，严重导致季节性饲草营养不平衡，雨季制作干草也比较困难，造成了“夏肥、秋壮，冬瘦、春死”的恶性循环。通过青贮技术可将牧区夏季富余的牧草或半农半牧区牧草及农作物秸秆调制成优质青绿饲料，不仅保存了原料营养成分，还能够达到长期保存的目的，有效解决饲草料供应的季节性制约问题[2]。

乳酸菌在青贮过程中起到举足轻重的作用，其数量、种类及活性是影响青贮饲料发酵品质的重要因素，国内外很多学者对乳酸菌在青贮饲料中的应用进行了大量的研究，主要包括优良乳酸菌的分离筛选[3]，其对青贮饲料发酵品质[4-5]和有氧稳定性的影响[6-7]以及青贮饲料添加乳酸菌在奶牛饲养中的应用等[8]。而青贮原料来源对青贮饲料乳酸菌特性具有很大的影响，如不同原料青贮饲料中所分布的乳酸菌数量及种类均存在有一定的差异[9-10]，还有同种原料不同环境温度条件或不同季节青贮饲料中所分离得到的乳酸菌也存在不同程度的差异[11-12]。目前青贮饲料研究原料来源较多，但针对天然牧草，尤其是对我国北方高寒地区天然牧草特有的乳酸菌种质资源研究还很薄弱，发挥其适应性的特性，为提高青贮品质和有氧稳定性，分离筛选青贮饲料中优良乳酸菌尤为重要。因此，本研究以呼伦贝尔草原天然牧草为原料，进行青贮发酵分离其乳酸菌，并对其表型特征、生理生化特性及16S rRNA进行分类鉴定，旨在筛选出优良乳酸菌菌株，为制备优质青贮饲料专用乳酸菌添加剂的研发和应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

于2011年8月初采自呼伦贝尔草原地区5个站点的牧草(表1)，刈割后将牧草切短至2～3 cm，装入聚乙烯袋，每袋重量200～300 g[9]，每个样品取3袋，然后用真空包装机抽真空并封口在室温条件下贮藏。青贮60 d后对各试验样品分别进行乳酸菌的分离与鉴定。

1.2培养基、试剂及仪器设备

MRS培养基购自Difco Laboratories(底特律，美国)。DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，PCR合成引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

主要仪器设备：超净工作台、Olympus BX5.1光学显微镜、恒温培养箱、蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器、PCR仪、凝胶成像电泳仪、超低温冰箱、pH计(雷磁PHSJ-5)、紫外可见双束分光光度计。

1.3试验方法

1.3.1乳酸菌的分离、纯化与保存在超净工作台中取待测青贮样品5 g，剪碎并混匀，放入装有45 mL无菌水的三角瓶，封口膜密封，置于摇床上振荡30 min，使乳酸菌细胞分散，静置30 s，配制成10-1,10-3和10-5稀释液。然后分别取20 μL菌液滴在MRS培养基上面用涂布棒涂抹均匀，将涂抹好的培养基静置20～30 min，使菌液渗透至培养基内，然后将其倒转，在37 ℃厌氧环境下进行培养。培养48 h后计数，并挑取典型菌落，进行革兰氏染色及镜检。

凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶反应呈阴性的菌株初步确定为乳酸菌，并采用平板划线法继续纯化2次后将菌株在Nutrient broth培养基(加入10%的二甲基亚砜)中，-80 ℃低温冰箱保存，备用。

1.3.2乳酸菌的鉴定1)表型特征鉴定：乳酸菌革兰氏染色法、生理生化试验、过氧化氢酶反应、不同梯度温度生长试验和耐盐试验均参考文献[13]中方法进行。

产气试验：将杜氏小管(排净空气)倒置于装有MRS液体培养基，灭菌后接种乳酸菌，培养2 d，观察杜氏小管内是否有气体出现，不产气体为同型发酵乳酸菌，产气体则为异型发酵乳酸菌。

表1　青贮材料及来源

耐酸试验：将培养好的乳酸菌单菌落转接到pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5和8.0等不同酸度MRS液体培养基中，培养7 d后取出来观察并记录乳酸菌的生长情况。

2)乳酸菌菌株16S rRNA序列的分子标记：取30 ℃条件下培养12 h的培养液各1 mL，13000 r/min离心10 min，沉淀物用于DNA提取，菌株16S rRNA PCR扩增引物：27f(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)和1492r(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；PCR反应体系(50 μL)包括：2×Taq PCR Master Mix为25 μL，20 pm的两种引物各2 μL，乳酸菌DNA模板3 μL，双蒸水为18 μL；扩增片段约为1500 bp；PCR扩增程序：预变性94 ℃ 5 min；变性98 ℃ 50 s，退火55 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 2 min，共30个循环后，72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。制备1.5%琼脂糖凝胶，0.5×TAE 缓冲液，用无菌枪头吸取5 μL扩增产物与3 μL 6×Loading Buffer混合，加样于琼脂糖凝胶点样孔中，电压为5 V/cm，电泳30 min。电泳结束后将琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色25 min，再放入凝胶成像仪下观察。PCR纯化产物送样进行双向测序(上海桑尼生物科技有限公司)。

利用BLAST待测菌株16S rRNA碱基序列与将GenBank数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行比对，选出与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，并从GenBank中提取已知标准菌株的16S rRNA基因序列与待测菌株的16S rRNA序列一同带入MEGA 4软件中，利用CLUSTAL W进行多重比较分析，并构建系统发育树[14]。

1.4优良乳酸菌菌株的筛选与确定

1.4.1乳酸菌产酸速率测定将分离并鉴定的乳酸菌菌株分别按3%的接种量接入无菌MRS液体培养基中，在37 ℃厌氧环境下培养48 h。从0 h开始到24 h每隔2 h及最后48 h测定菌株发酵液的pH值，根据每株乳酸菌从开始至12 h的7个发酵时间点所对应的发酵液pH值绘制出产酸速率曲线图。

1.4.2生长曲线的制作将乳酸菌菌株24 h的发酵液，接种量为3%，接种于无菌MRS液体培养基中，在37 ℃厌氧环境下培养36 h。从开始每隔2 h取1次样品，以无菌MRS培养基为空白，在波长为620 nm下测定样品的吸光度值(OD值)，横坐标为培养时间，纵坐标为OD值，绘制生长曲线图。

1.5统计分析

采用Excel软件进行数据统计和曲线图制作，并用MEGA 4软件构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1分离乳酸菌菌株生理生化鉴定

本试验从呼伦贝尔草原天然牧草青贮饲料中分离出的5株乳酸菌菌株DME53、DMG108、DMC80、DMG138和DMG139(表2)。分离菌株的生理生化鉴定结果如表3所示，5菌株均为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性菌，能够在NaCl浓度为 3.0%和6.5%，温度为5和10 ℃，pH为4.5，5.0和7.5等环境条件下生长。其中，菌株DMG139为球菌，其余4菌株均为杆菌；DMG138发酵葡萄糖产气体，属于异型发酵乳酸菌，而其余菌株发酵葡萄糖不产气体，均属于同型发酵乳酸菌。除菌株DMG139在40和45 ℃条件下弱生长，其余菌株均能够良好生长。在pH 3.0条件下，菌株DME53不能生长，其他4菌株均弱生长；在pH 3.5条件下，5菌株均弱生长；在pH 4.0条件下，只有DMC80良好生长，其余菌株均弱生长；当pH 8.0时，除DMG138，其余菌株均能够良好生长。

表2　牧草青贮饲料中分离的乳酸菌菌株

表3　青贮饲料中乳酸菌菌株的特性

注：“+”表示能良好生长，“-”表示不能生长，“W”表示弱生长。

Note: “+” means positive, “-” means negative, “W” means weakly positive.

2.2分离菌株16S rRNA基因序列测定及系统进化树的构建

5株乳酸菌菌株16S rRNA PCR扩增序列长度分别大于1460 bp，在GenBank中进行16S rRNA基因同源性序列比对，经BLAST比较鉴定，与标准乳酸菌菌株序列相似性均达到了99%以上。如图1所示，5株乳酸菌菌株聚类为2属，分别为乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)，其中菌株DMC80为植物乳杆菌(L.plantarum)、DME53为草乳杆菌(L.graminis)、DMG108为干酪乳杆菌(L.casei)、DMG138为短乳杆菌(L.brevis)、DMG139为戊糖片球菌(P.pentosaceus)。表4中列出用于MEGA4.0软件构建系统发育树的5种乳酸菌参考菌株。

图1　基于16S rRNA基因序列建立的乳酸菌系统进化树Fig.1　Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of five LAB strains

2.3 乳酸菌菌株产酸能力比较

5株乳酸菌菌株产酸能力比较分析结果见图2,表现出相似的产酸速率。5菌株在0～4h产酸速率较快,4～6h逐渐变缓,8～12h基本趋于平稳。菌株DMC80、DME53、DMG108、DMG138和DMG139发酵12h之后的pH值分别为3.93,4.49,4.28,4.34和4.38。DMC80的产酸速率最快,与其余4菌株存在显著差异(P<0.05),其次为菌株DMG108。也就是说,随着发酵时间的延长,菌株DMC80的pH值始终处于最低水平,产酸能力最强。

2.4 乳酸菌菌株生长曲线的测定

表4　用于构建系统发育树的乳酸菌参考菌株

由图3可知,5株乳酸菌均在2～4h时开始进入对数生长期，4～10 h时生长速度达到最大，10～12 h时开始进入稳定期，之后pH值和OD值变化较小，但均稍有增加的趋势，在发酵过程中没有出现明显的衰退期。5株乳酸菌DMC80、DME53、DMG108、DMG138和DMG139发酵36 h的OD值分别为3.41，2.77，3.27，2.79和2.69。菌株DMC80的生长速度最快。说明5株菌在MRS液体培养基中0～10 h的代谢活动较快，能使细胞迅速分裂增长，促进乳酸的生成，使pH值快速降低，进入稳定期保持不变，进而在青贮发酵进程中抑制有害菌的生长。

3　讨论

目前，国内外有关不同原料青贮饲料乳酸菌分类鉴定的相关报道较多，主要分类为乳杆菌、片球菌、明串珠菌、肠球菌、乳球菌、链球菌以及魏斯特氏菌7个属[3-4,15]。不同原料来源，具有不同的营养成分，导致青贮过程中微生物尤其是乳酸菌的多样性。乳酸菌在饲草青贮发酵过程中起着重要的作用，其种类、数量和活性是抑制不良微生物生长和减少营养损失的一个重要因素，发酵品质取决于青贮原料表面附生乳酸菌数量和底物含量[16-17]。

图2　乳酸菌菌株的产酸速率曲线Fig.2　Rate of lactic acid production in LAB

图3　乳酸菌菌株的生长曲线Fig.3　Growth curve of LAB

自然界中，植物表面附生乳酸菌的数量较少，一般达不到良好发酵所需的最低水平105cfu/g FM[18]，而且以异型发酵乳酸菌为主，在青贮过程中很难成为优势菌群，难以保证青贮饲料发酵品质。因此，分离青贮饲料中生长迅速、产酸能力强、抗逆性较强的优质乳酸菌显得尤为重要。本试验中，从呼伦贝尔草原牧草青贮饲料中分离获得5株乳酸菌菌株，经传统鉴定方法及16S rRNA序列分析，菌株DMC80为植物乳杆菌，DME53为草乳杆菌，DMG108为干酪乳杆菌，DMG138为短乳杆菌，DMG139为戊糖片球菌。

在自然青贮发酵过程中，环境温度是影响乳酸菌活性的重要因素之一[11]。Cao等[12]对不同季节的TMR青贮进行研究结果表明，冬季的低温条件限制乳酸菌活性的发挥。呼伦贝尔草原位于我国东北部，年平均温度0 ℃左右，无霜期85～155 d，具有气温低，昼夜温差大等气候特点，可能会限制商品乳酸菌菌剂的生长及活性的发挥。Liu等[19]研究报道，在20 ℃条件下，商品乳酸菌的活性会受到影响，不能很好地发挥作用。而本研究中所分离到的5株乳酸菌均能够在5 ℃条件下生长旺盛，具有较强的耐低温特性，体现了分离到的乳酸菌对高寒环境的适应性。

产酸速率和生长速率是筛选优良乳酸菌的重要指标，同时也是体现乳酸菌活性的重要特征，不同菌株间存在一定程度的差异。McDonald等[16]指出作为理想的青贮用乳酸菌添加剂必备的条件是：1)生长旺盛，迅速成为优势菌群，抑制有害微生物的活性；2)同型发酵乳酸菌，迅速增加乳酸的生成浓度及速率，使pH值迅速降至4.0左右；3)耐酸能力强，在低pH环境下能很好地生长或保持其活性；4)可利用多种单糖和多糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果胶糖，尤其是戊糖等。后来有大量研究证明，异型发酵乳酸菌能够提高有氧稳定性，防止二次发酵。当青贮饲料暴露于空气中时，同型发酵乳酸菌植物乳杆菌能产生大量乳酸，但产生的抑制酵母菌和霉菌生长的短链脂肪酸却很少[20]，由于产生的乳酸为乳酸同化型酵母菌提供了底物，从而引起饲料的腐败和霉变。而异型发酵乳酸菌如布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)则提高乙酸的产生量，抑制了酵母菌的生长，从而提高了青贮饲料的有氧稳定性的改善[21]。本试验所分离到的5株乳酸菌中，菌株DMC80发酵12 h后的pH值最低(3.93)，发酵36 h的OD值最高(3.41)，产酸能力最强，发酵速度最快的植物乳杆菌；也具有较强的耐酸特性，能够在pH 3.0～3.5条件下生长，pH 4.0时生长旺盛，具备了理想的青贮添加剂菌种的条件。

大多数青贮饲料接种菌中均包含植物乳杆菌，通常与其他的乳酸菌混合使用。植物乳杆菌作为同型发酵乳酸菌接种剂，能够产生大量乳酸，迅速降低pH值，抑制有害微生物的生长，降低营养物质的损失，从而提高青贮饲料的品质。但它也有其局限性，如在厌氧条件下，pH 5.0以上时，植物乳杆菌一般很难生长，因此一般选用更适合青贮发酵初始条件的菌种如屎肠球菌(Enterococcusfaecalis)和戊糖片球菌[22]，也有与效果较好的异型发酵乳酸菌布氏乳杆菌混合使用，以便提高青贮饲料有氧稳定性，防止二次发酵[7]；也有与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)搭配使用，能够产生淀粉酶和纤维素酶，将多糖降解成二糖或单糖，为乳酸菌的生长繁殖提供更多的发酵底物[23]。现也有在青贮饲料中使用复合酶菌制剂，针对结构性碳水化合物含量较高的原料，使用酶制剂将青贮原料中纤维素、半纤维素降解为水溶性碳水化合物，提高糖分质量，为乳酸菌提供更多的发酵碳源[24]，促进乳酸发酵，从而乳酸菌和酶混合制剂可进一步提高青贮饲料发酵品质[25]。

本试验分离得到的植物乳杆菌DMC80为制备优良青贮菌剂提供了可能，对于能否可作为呼伦贝尔地区青贮饲料添加剂菌种以及其添加水平，还需有待进一步证实。

4　结论

本研究从呼伦贝尔草原牧草青贮饲料中分离得到5株乳酸菌菌株，经过经典鉴定方法和16S rRNA序列分析归类为2属5种，分别为乳杆菌属和片球菌属的植物乳杆菌，戊糖片球菌，短乳杆菌，干酪乳杆菌和草乳杆菌，其中植物乳杆菌DMC80产酸能力最强，发酵速度最快，耐酸和耐低温能力较强，适宜用作呼伦贝尔地区青贮饲料乳酸菌添加剂的菌种。

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Isolation and identification of high-quality lactic acid bacteria from wild forage silages on the Hulunbuir prairie

WANG Hong-Mei1, SUN Qi-Zhong2, TU Yan1, SI Bing-Wen1, SA Ru-La2, NA Ya3, DIAO Qi-Yu1*

1.FeedResearchInstitute,KeyLaboratoryofFeedBiotechnology,theMinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China; 3.CollegeofEcologyandEnvironmentalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010011,China

The objectives of this study were to identify lactic acid bacteria (LAB) from forage silages on the Hulunbuir prairie and screen LAB for desirable attributes. LAB strains were isolated from grass silages of four different communities and identified with classical identification and 16S rRNA analysis methods. Five strains: DME53, DMG108, DMC80, DMG138 and DMG139 were isolated and identified asLactobacillusgraminis,L.casei,L.plantarum,L.brevisandPediococcuspentosaceus, respectively, in which DMG138 was identified as heterofermentative LAB while the other four strains were all homofermentative LAB. All five strains grew well at different temperatures, ranging from 5 to 45 ℃, and in 3.0% and 6.5% NaCl; an exception was that DMG139 grew poorly at 40 and 45 ℃. All strains generally grew well at pH ranging from 3.0-8.0; however, DME53 was inactive at pH 3.0. In conclusion, strain DMC80 demonstrated consistently desirable traits; strong acid production capacity, rapid fermentation rate and good tolerance of acidity and cold which could be used for the preparation of silage in Hulunbuir prairie.

lactic acid bacteria;Lactobacillusplantarum; silage; forage; Hulunbuir prairie

10.11686/cyxb2016092http://cyxb.lzu.edu.cn

王红梅, 孙启忠, 屠焰, 司丙文, 萨如拉, 那亚, 刁其玉. 呼伦贝尔草原野生牧草青贮中优良乳酸菌的分离及鉴定. 草业学报, 2016, 25(8): 189-196.

WANG Hong-Mei, SUN Qi-Zhong, TU Yan, SI Bing-Wen, SA Ru-La, NA Ya, DIAO Qi-Yu. Isolation and identification of high-quality lactic acid bacteria from wild forage silages on the Hulunbuir prairie. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 189-196.

2016-03-01；改回日期：2016-04-07

公益性行业(农业)专项(20120304202)和内蒙古自治区科技重大专项资助。

王红梅(1983-)，女，内蒙古通辽人，博士后。E-mail: chasu927@163.com

Corresponding author. E-mail: diaoqiyu@caas.cn