骨关节炎软骨细胞对白细胞介素18的炎症应答

付兆宗，江建明，赵振东，司沙沙，谢清华，刘一涛中山大学附属江门医院（江门市中心医院）脊柱骨科，广东江门 5900；南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 5055；江门市中心医院生殖中心，广东 江门 5900

临床研究

骨关节炎软骨细胞对白细胞介素18的炎症应答

付兆宗1，江建明2，赵振东1，司沙沙3，谢清华1，刘一涛1
1中山大学附属江门医院（江门市中心医院）脊柱骨科，广东江门 529030；2南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515；3江门市中心医院生殖中心，广东 江门 529030

目的 探讨IL-18对骨关节炎软骨细胞的作用。方法 取骨关节炎患者的膝关节软骨，进行原代细胞培养。不同浓度的IL-18（0，50，150，300 ng/mL）刺激软骨细胞，RT-PCR检测TNFα和COX-2 mRNA的表达，ELISA检测TNFα、PGE2的水平。应用IL-1受体阻断剂（IL-1Ra）+IL-18干预软骨细胞，检测软骨细胞COX-2的表达量和培养液中PGE2的水平。提取软骨细胞RNA，测定IL-18受体的表达。结果 对于COX-2和TNFα，300 ng/mL组和150 ng/mL组mRNA的表达量显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05）。50、300 ng/mL组的PGE2水平显著高于对照组（P＜0.05）。150、300 ng/mL组的TNFα蛋白的浓度显著高于对照组（P＜0.05），IL-1Ra组的PGE2浓度高于对照组（P＜0.01），但是低于IL-18组（P＜0.01）。软骨细胞能够检测到IL-18受体的表达。结论 IL-18诱导软骨细胞产生炎症应答，这种作用和IL-1β有关但不完全依赖IL-1β。

骨关节炎；白细胞介素18；软骨细胞；退行性变

骨性关节炎（OA）是全球最常见的关节疾病，给社会造成巨大的经济负担［1-2］。我国OA的发病率约为4%。60岁以上者膝骨性关节炎发病率高达49%，每年消耗的医疗费用超过1500亿元［3］。因此，早期有效的治疗OA具有重大的社会效益和经济效益。目前OA的治疗方法多样，但是难以阻止病情进展，大量患者最终需接受关节置换手术。虽然手术能够一定程度提高生活质量，但是给患者带来较大的创伤和医疗负担，且存在血栓形成、关节内感染、假体松动等并发症［4-5］。另外，随着人口平均寿命的延长以及OA发病的年轻化，平均寿命为10～15年的关节假体需慎用于65岁以下的患者。因此，如何针对OA的发病机制，寻找新的、有效的治疗方法一直是骨关节炎研究领域的热门课题。

OA是多种炎症因子参与的关节退变疾病。软骨破坏是其主要病理特征，软骨碎片进入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎，滑膜释放序贯性的炎性介质，进一步降解软骨，形成恶性循环［6］。白细胞介素1β诱导软骨细胞产生NO、iNOS、PGE2、MMPs等损伤性的炎症因子［7］，导致软骨细胞的炎症反应和软骨基质的降解［8-10］。IL-18的结构与IL-1相似，被认为是IL-1超家族的一员［11-12］。类风湿关节炎（RA）患者的膝关节滑液中可以检测到IL-18的表达，同时，RA的关节滑膜中也可检测到IL-18R的存在［13-14］。前人的研究探讨了高浓度的IL-18对RA滑膜细胞和RA患者外周血单核细胞的影响，并发现对后者的促炎作用更加显著。但是，IL-18对OA软骨细胞的作用尚未有确切报道。IL-1能够诱导PGE2的产生和COX-2的基因表达，并诱导iNOS的产生［15］。但是，IL-1β和IL-18在这种作用中的关系尚不清楚。本研究探讨了IL-18在OA发病过程中的作用，分析了IL-18和IL-1在促炎作用中的关系，为OA的靶向治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞培养与分组

实验所用的软骨细胞来自8名OA患者（5女，3男，平均年龄62.3岁）。取材过程获得患者的知情同意。关节软骨切成2～3 mm³的小块，DMEM（Gibco，USA）冲洗3次，10%的胰蛋白酶37℃下消化15 min。收集组织，加入0.2%的II型胶原酶（Gibco，USA）和0.1%的透明质酸酶（Sigma，USA）37℃摇床消化6 h。除去消化酶，DMEM清洗，无菌细胞筛过滤。用含10%FBS的DMEM悬浮细胞并进行原代培养。倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态。检测软骨细胞的特异性胶原——Ⅱ型胶原进行细胞鉴定。原代细胞接种至六孔板。原代培养的软骨细胞加入不同浓度的IL-18（0、50、150和300 ng/mL）孵育48 h，收集上清液，完成ELISA检查。提取细胞总RNA，进行后续PCR实验。

为进一步研究IL-18和IL-1的炎症诱导作用，取5例软骨细胞分为3组：对照组不加干预，IL-18组加入100 ng/mL的IL-18，IL-1Ra（IL-1受体抑制剂）组软骨细胞加入100 ng/mL的IL-18和IL-1Ra（R&D，USA），孵育24 h。收集细胞上清液，ELISA法检测PGE2的水平。

1.2细胞免疫化学检测

8 mm×8 mm载玻片泡酸并消毒后放入六孔板，接种软骨细胞，培养24 h，完成爬片。弃去培养基，PBS清洗3次，每次3 min。3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，动物血清封闭非特异性蛋白。去除残留血清，加入II型胶原兔多克隆抗体（Boster，China），放入湿盒中4℃过夜。加入羊多克隆抗体（Boster，China），37℃孵育30 min。加入辣根过氧化物酶底物和DAB显色剂，倒置显微镜下观察并采集图像。

1.3细胞因子检测

收集细胞培养上清液至1.5 mL离心管，3000 g/min离心后放-80℃低温冰箱保存，集中测定细胞因子浓度。应用酶联免疫吸附试验（ELISA），根据试剂盒厂家的说明书（PGE2:Uscn Life，China；TNFα:Cusabio，China）绘制标准曲线，计算PGE2和TNFα的浓度。

1.4RT-PCR检测

应用Trizol（Invitrogen，USA）裂解培养的软骨细胞，提取总RNA。260 nm分光光度计（NanoDrop，Wilmington，USA）测定mRNA浓度。应用逆转录试剂盒（Toyobo，Japan）（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行逆转录反应（Applied biosystems，Foster City，CA）。反应条件：30℃-10 min，42℃-20 min，95℃-5 min。应用ABI7500 PCR（Applied biosystems，Foster City，CA）系统完成定量PCR。双delta Ct法进行定量分析［16］。取PCR产物进行凝胶电泳分析。取4例患者软骨细胞，参考Moller等的研究检测IL-18Rα和IL-18Rβ的表达［17］。

1.5统计分析

应用SPSS13.0软件包进行统计分析。细胞因子的浓度及mRNA水平均表示为均数±标准差，P＜0.05有统计学差异。不同浓度IL-18对软骨细的胞影响采用多样本比较的方差分析，若有统计学差异，则采用LSD法或者Dunnetts'T3（方差不齐时）进行多重比较。

2　结果

2.1软骨细胞的形态观察和鉴定

接种后1 d软骨细胞呈圆形或椭圆形，透光度高（图1A），细胞稳定贴壁后成多边形，核大（图1B）。软骨细胞Ⅱ型胶原染色阳性，细胞间分布有网状的Ⅱ型胶原（图1C），对照组未见Ⅱ型胶原阳性染色（图1D）。

2.2RT-PCR和ELISA检测炎症因子的水平

随着IL-18浓度的升高，COX-2和TNFα的mRNA表达量升高（图2）。无论是COX-2还是TNFα，300 ng/mL组和150 ng/mL组的表达量显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05）。检测不同浓度IL-18干预下，炎症蛋白的水平（表1）。50 ng/mL组、150 ng/mL组和300 ng/mL的PGE2浓度分别为410.03±22.97、460.38±112.86、518.28± 38.80 pg/mL，均高于对照组（340.47±22.03 pg/mL，P= 0.003，P＜0.001和P＜0.001，图3A）。同样，与对照组相比，150 ng/mL组和300 ng/mL组的TNFα（52.45±10.93 pg/mL和103.80±22.29 pg/mL）显著增高（P=0.002，P＜0.001，图3B）。IL-18诱导PGE2和TNFα的增高，呈浓度依赖效应。

2.3IL-1Ra对软骨细胞炎症应答的影响

IL-18干预下，无论是否加入IL-1Ra，COX-2的表达上调（图4）。对照组、IL-18组和IL-1Ra组的PGE2浓度分别为140.26±23.63 pg/mL、399.27±70.27 pg/mL和268.16±36.45 pg/mL，IL-18组和IL-Ra组PGE2的水平显著高于对照组（P＜0.001，P=0.002），而IL-18组的PGE2浓度显著高于IL-Ra对照组（P=0.003，图4）。

2.4RT-PCR检测IL-18R的表达

RT-PCT检查软骨细胞IL-18受体的表达（图5）。尽管表达强度不一致，软骨细胞中均可检测到IL-18Rα的表达，2例检测到IL-18β的表达。图中呈现的是4例患者软骨细胞（B）中IL-18Rα和IL-18β mRNA的表达。

表1　IL-18干预后PGE2、TNF-α的水平（，pg/mL）

表1　IL-18干预后PGE2、TNF-α的水平（，pg/mL）

*P＜0.01 vs PGE2in 0 ng/mL group；#P＜0.01 vs TNF-α in 0 ng/mL group.

TNF-α（n=8）20.48±7.36 25.32±9.55 52.45±10.93#103.80±22.29#Group 0 ng/mL 50 ng/mL 150 ng/mL 300 ng/mL PGE2（n=8）340.47±22.03 410.03±22.97* 460.38±112.86* 518.28±38.80*

3　讨论

IL-18诱导OA软骨细胞的炎症应答。本研究发现IL-18能够诱导软骨细胞表达TNFα和PGE2，刺激软骨细胞生成过量的COX-2。COX-2通过降解花生四烯酸产生PGE2。一旦PGE2过量，将导致软骨代谢失衡，诱发软骨降解［18］。关节液中TNFα的水平和OA病情紧密紧密相关，是OA炎症进展的促进因素［19-20］。另外，本研究还发现OA软骨细胞均表达IL-18Rα，且部分表达IL-18Rβ。IL-18对细胞的刺激依赖于这两种受体，然后通过NF-κB途径完成信号转导，引起细胞炎症应答［22］。

IL-18可能通过上调某些细胞因子的含量，引起OA的症状。TNF-α是OA病理过程中重要的细胞因子之一，许多研究发现OA的功能评分与TNF-α的含量具有相关性［19，21］。另外，TNF-α和PGE2一起加重OA患者膝关节的疼痛、肿胀等临床症状。Notoya等［23］也对IL-18和TNF-α做了部分研究，并发现，由于IL-18能够诱导IL-1β和TNF-α的mRNA表达，后两者在对软骨细胞的作用类似于IL-18。IL-18对软骨细胞的影响可能依赖于IL-1或TNFα，或者受到二者的影响［23］。

IL-18和IL-1β对软骨细胞的作用既有交叉又相互独立。IL-1β促进软骨细胞分泌炎症因子，并分泌基质金属蛋白酶，导致软骨基质的降解，是OA发病过程中典型的促炎因子［24-25］。IL-18在功能上与IL-1β有相似之处，二者均促进软骨细胞分泌炎症因子。然而，IL-1Ra阻断IL-1β的作用后，IL-18仍然能成功诱导软骨细胞的炎症应答，但是PGE2和TNFα的水平有所降低。这表明IL-18发挥作用部分依赖于IL-1β，但并不全依赖于IL-1β。可能与二者的传导通路有关。IL-18通过MAPK-p38-AP1途径和NF-κB途径促进COX-2的产生［26-27］，而IL-1β可以通过p38 APK/c-Fos/AP-1和JAK2/STAT1/2途径诱导基质金属蛋白酶的产生。不同的信号通路导致了IL-18和IL-1β的不同效应。

关节液主要来自滑膜细胞的分泌和软骨细胞的部分代谢产物，是关节软骨自我更新所依赖的环节。OA患者滑膜细胞产生更多的IL-18，并通过类似自分泌的方式影响滑膜细胞［28］，总体结果增加了关节液中IL-18的浓度。我们的体外实验一定程度上模拟了软骨细胞在高浓度IL-18的干预下主要促炎因子的变化，体外特定的干预有利于剔除活体代谢中的混杂因素。但是，由于正常情况下关节液较少，且为伦理学所限制，目前尚无大样本的研究确定生理状态、病理状态下关节液中IL-18的浓度。我们体外实验中干预浓度的确定一方面参考了前人的研究［29］，另一方面是基于预实验的结果。尽管如此，仍能说明IL-18对软骨炎症代谢活动的影响。

IL-18能够增加典型炎症因子的表达，可能处于炎性反应的上游。既往的研究表明，IL-1在OA的发病过程中起重要的作用，本实验发现IL-18对OA软骨细胞的影响可能与IL-1有关，但是其促炎作用相对独立于IL-1对软骨细胞的影响。因此，阻断或抑制IL-18的代谢过程可能对实现早期OA的靶向治疗具有重要的价值。

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Inflammatory responses of human osteoarthritic chondrocytes induced by interleukin 18

FU Zhaozong1，JIANG Jianming2，ZHAO Zhendong1，SI Shasha3，XIE Qinghua1，LIU Yitao1
1Department of Spine surgery，Affiliated Jiangmen Hospital of Sun Yat-sen University（Jiangmen Central Hospital），Jiangmen 529030，China；2Department of Spine surgery，Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；3Reproductive center，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen 529030，China

Objective To explore the role of interleukin 18（IL-18）on the osteoarthritis（OA）patients'chondrocytes.Methods Knee cartilage samples were obtained from osteoarthritic patients，and the primary cells were cultured.After stimulated by IL-18（0，50，150，300 ng/mL），chondrocytes were collect to obtain the total RNA，and the supernatant were extracted，too.The mRNA’s expression of COX-2 and TNFα were detected by quantitative RT-PCR and the level of PGE2and TNFα were investigated using ELISA.Besides IL-18，IL-1 receptor inhibitor（IL-1Ra）was also added into the medium of cell culture. COX-2 mRNA and PGE2were respectively determination.IL-18 receptors in chondrocytes were detected by RT-PCR.Results mRNA expression of COX-2 and TNFα in 150 and 300 ng/mLwere both significantly higher than that in control group（P＜0.05）. The level of in 50 and 300 ng/mL group were higher than that in control group（P＜0.01）.While the concentration of TNFα in 150 and 300 ng/mL groups appeared more than that in control group significantly（P＜0.01）.And the density of PGE2in IL-Ra group was significantly more than that in control group，but less than that of IL-18 group.IL-18R can be detected on chondrocytes.Conclusion IL-18 induces inflammatory responses in osteoarthritic chondrocytes and that this effect was related with，although not entirely dependent on，IL-1β.

osteoarthritis；interleukin 18；chondrocytes；degradation

2016-03-03

国家自然科学基金（30571890）；广东省自然科学基金（2015A030310248）

付兆宗，博士，主治医师，E-mail:doctor1999@126.com

江建明，硕士，教授，E-mail:doctor2003@126.com