海洋石油烃降解菌的驯化、分离与16S rDNA分子鉴定

邓保乐

（天津市环境监测中心，天津 300191）

海洋石油烃降解菌的驯化、分离与16S rDNA分子鉴定

邓保乐

（天津市环境监测中心，天津 300191）

本次研究采用的样品为取自天津海滨潮间带的沉积物，由于受到严重的石油烃污染，样品含油量高达0.2g/g；采用的碳源为柴油，两个浓度梯度分别为1%、2%。此次试验通过逐渐驯化培养样本中石油烃降解菌群的方式，获取了降解能力更加出色的石油烃降解菌，具体操作中借助选择培养基平板涂布法实现了驯化菌群的分离纯化，并选取了两株长势相对较好的降解菌（下文分别以T1、T2指代）开展了16S rDNA测序鉴定，检验结果为T1与深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）的16S rDNA序列的相似性为89%，菌株T2与施氏假单孢杆菌（Pseudomonas stutzeri）的16S rDNA序列的相似性为99%。

石油烃 降解菌 驯化 分离 鉴定 16S rDNA

1　引言

油田开发对缓解石油供应压力有着明显的积极作用，但针对海上油气田展开的探测与开发活动，也使得石油污染问题日渐突出。本次研究采用的样品为取自天津海滨潮间带的沉积物，由于受到严重的石油烃污染，样品含油量高达0.2g/g；采用的碳源为柴油，两个浓度梯度分别为1%、2%。此次试验通过逐渐驯化培养样本中石油烃降解菌群的方式，获取了降解能力更加出色的石油烃降解菌，具体操作中借助选择培养基平板涂布法实现了驯化菌群的分离纯化，并选取了两株长势相对较好的降解菌（下文分别以T1、T2指代）开展了16S rDNA测序鉴定。

2　材料与方法

2.1供试沉积物样品

实验所用样品取自受到严重石油污染的天津驴驹河附近滩涂地区，该处污染面积达到了200m2，总石油烃含量达0.2g/g，且被污染时间在2年以上，已经有翅碱蓬在污染地区生长［6］。

2.2药品及试剂

柴油为市售0#柴油（密度为0.862g/cm3），主要成分是饱和烷烃与芳香烃。试验中采用的分析纯主要有三种：①磷酸氢二钾。②磷酸二氢钾。③磷酸氨。采用的化学纯为磷酸铁。十二烷基硫酸钠。各种限制酶、Taq酶、蛋白酶K、PMD18-T载体、X-gal、IPTG、琼脂糖、鼎国DNA PCR产物快速回收试剂盒，均购自日本TaKaRa公司。

2.3培养基

富集培养液Ⅰ：①浓度梯度为1%（V/V）的柴油。②浓度为0.01 g/L的KH2PO4。③浓度为5.0g/L为（NH4）2SO4。④陈海水，pH为自然值；

富集培养液Ⅱ：浓度梯度为2%（V/V）的柴油；其他构成与富集培养液Ⅰ相同；

平板筛选培养基：①浓度为2.0g/L的蛋白胨。②浓度为2.0g/ L的（NH4）2SO4。③浓度为0.5g/L的酵母膏。④浓度为0.4g/L的K2HPO4·3H2O。⑤浓度为0.6g/L的KH2PO4。⑥1%的柴油。⑦2%的琼脂。⑧陈海水，pH为自然值。

2.4石油烃降解菌的驯化与筛选分离

此次操作在无菌环境下进行，流程依次为：①称取样品并将其置于富集培养液Ⅰ内，二者质量分别为10g、200mL。②150rpm，26℃，摇床恒温富集培养一周。③将培养液摇匀，并把其中的50%转移到新鲜富集培养液Ⅰ中进行继续培养。④依照上述方法培养三次，并把其中50%转移到富集培养液Ⅱ中进行三次富集培养。

表1　驯化培养过程中分离到的菌落种类数及降解率

驯化培养后的培养液采用平板涂布分离法，在平板筛选培养基上对降解菌群进行分离纯化。分离出的单菌株用斜面培养基，4℃冰箱保存。

3　结果与讨论

3.1高效石油烃降解菌的驯化与筛选分离

供试沉积物样品经过6次、2个柴油梯度的富集培养后，经平板分离，仅得到4株菌落形态各异的细菌，其中以两种分别为乳白色和淡黄色的菌落为主。伴随每次富集培养，都进行了平板分离，每次分离后得到的菌株数量随富集次数而递减，特别是富集培养液中柴油浓度增加至2%后，筛选到的菌株数量剧减。另外，随着富集次数增加，菌群的石油烃降解能力逐渐增加，其中对柴油组成中主要的14种烷烃的降解效率增加显著，驯化后期能够在3天内将14种主要烷烃全部降解，而对芳烃组分的降解效果提高不明显，基本在30%多。驯化培养过程中，每次平板分离到的菌落种类数、对柴油组分中14种主要烷烃以及芳香烃的降解率见表1。

a表示驯化培养液中柴油浓度为1%；b表示驯化培养液中柴油浓度为2%。

3.216S rDNA序列测定

菌株T1和T2在ZoBell 2216E液体培养基中进行纯培养后，提取细菌的总DNA。借助细菌16S rRNA通用引物对提取的两株菌株进行总DNA提取物PCR扩增，即可获取一约1500碱基对长的片段。根据PCR结果可知，扩增具有较高的特异性，用来克隆16S rDNA是可行的。16S rDNA的PCR扩增产物纯化后，通过末端补平磷酸化、连接PMD18-T载体，可转化至E.coli DH5α中，借助蓝白斑筛选可获得重组质粒，通过对其进行双切酶验证、PCR验证、KpnⅠ单酶切验证，即可明确插入片段是否正确。

将所测得序列输入NCBI Genbank数据库，用BLAST程序进行比对分析，结果发现，T1与深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）的16 S rRNA基因序列的相似性为8 9%；T2与假单孢菌属（Pseudomonas sp.）很自然地组成一群，尤其与施氏假单孢杆菌（Pseudomonas stutzeri）的16S rRNA基因序列的相似性最大（99%），可以确定T2为假单孢菌属施氏假单孢杆菌种。

当前针对深红红螺菌展开的各项报道，往往关注的是其产氢、固氮作用，而关于其解烃作用的讨论尚不多见，所以还无法肯定T1即为深红红螺菌。T2同样能够存活于海洋中，对高盐度环境表现出了良好的适应性，且其在2216E培养基平板上与施氏甲单孢杆菌有着相同的菌落形态，再加上其单细胞呈现杆状、与施氏假单孢杆菌具有相似度99%的16S rRNA序列，可以初步断定该菌为假单孢菌属施氏假单孢杆菌种。

4　结语

（1）利用不同柴油浓度剃度对污染沉积物中的土著降解菌进行连续驯化培养，能够很好地驯化并筛选土著菌群，可以有目标的分选出降解能力强，且能够用常规培养基及培养方法培养的降解菌株，以用于石油污染生物修复；

（2）利用16S rDNA序列比对方法，快速地对分选到地降解菌株进行了初步鉴定分类。