NEK2对肝癌细胞株HepG2迁移侵袭的影响及其机制的研究

张东强　　徐细明　　张美霞

武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉　430060

NEK2对肝癌细胞株HepG2迁移侵袭的影响及其机制的研究

张东强徐细明▲张美霞

武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉430060

目的 探讨NEK2基因对人肝癌细胞株HepG2迁移侵袭能力的影响及其机制。方法 通过实时荧光定量PCR及Western blot法检测4种人肝癌细胞系HepG2、Huh7、SMMC、7402中NEK2的表达水平，并选用正常肝细胞株LO2作为参考。设计siRNA序列转染HepG2细胞，将HepG2细胞分为3组：空白对照组（细胞未做任何处理）、阴性对照组（细胞转染无义序列）及干扰组（细胞转染NEK2-siRNA序列）。观察转染前后HepG2细胞中的NEK2表达水平变化。利用Transwell小室观察转染前后细胞迁移及侵袭能力的改变。应用蛋白印迹技术检测MMP2、MMP9、TIMP-1蛋白的表达情况。 结果5种细胞株中，NEK2在HepG2细胞中的表达量最高，与LO2细胞比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。HepG2细胞转染NEK2-siRNA后，与空白对照组及阴性对照组比较，干扰组NEK2的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。Transwell小室检测细胞迁移，空白对照、阴性对照的穿膜细胞数分别为（415.00±6.36）、（411.75±9.90），与干扰组比较（99.50±7.07），差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。Transwell小室检测细胞侵袭，空白对照组、阴性对照组的穿膜细胞数分别为（220.50±6.40）、（219.75± 3.54），与干扰组（38.50±3.54）比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；转染NEK2-siRNA 48 h后，HepG2细胞中TIMP-1蛋白表达较空白对照组、阴性对照组明显上调，而MMP2及MMP9蛋白表达明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论NEK2可能通过TIMP-1、MMP2及MMP9调控人肝癌HepG2细胞的侵袭转移。

NEK2；siRNA；迁移；侵袭

［Abstract］Objective To identify the effects of NEK2 on migration and invasion and the related mechanism in human liver cancer cells of HepG2.Methods Real-time PCR and Western blotwere used to detect the NEK2 expression in HepG2，Huh7，SMMC，7402 cell lines and LO2 as the control.To design siRNA sequence to transfect into the HepG2 cells.The experimentwas divided into three groups：blank control（cells with no disposes）；negative control（cellswere transfected withmeaningless sequence）and interference group（cellwere transfected with NEK2-siRNA sequence）.The expression level of NEK2 was observed before and after transfection.The transwell chamberswas employed to detect ability of migration and invasion of HepG2 cells.Western blot approach was used to detect the expression levels of MMP2，MMP9 and TIMP-1.Results In the five kinds of cell lines，the expression of NEK2 was the highest in HepG2 cells，compared with the LO2 cell the difference was significant（P＜0.01）.After transfection of HepG2 cells with NEK2-siRNA，the expression level of NEK2 was attenuated，compared with blank control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell migration capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（415.00± 6.36），（411.75±9.90），compared with the NEK2-siRNA group（99.50±7.07），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell invasion capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（220.50±6.40），（219.75±3.54），compared with the NEK2-siRNA group（38.50±3.54），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.The protein expression of TIMP-1 in the NEK2-siRNA group was increased significantly，and the protein expression of MMP2 and MMP9 was decreased，compared with that in the blank control group and negative control group，the differenceswere significant（P＜0.05）.Conclusion NEK2 may regulate invasion and migration of HepG2 cells via TIMP-1，MMP2 and MMP9.

［Key words］NEK2；siRNA；Transference；Invasion

原发性肝癌是中国常见的消化系恶性肿瘤，其发病率逐年增加，每年有超过600 000人死于肝癌［1］。目前对于肝癌的治疗方法仍以早期手术切除为主，结合化疗、介入、射频消融等手段［2］，虽可显著改善患者的生活质量，延长生命，但对于肝癌患者，复发和转移仍是常见的死亡原因［3-4］。而现阶段对于肝癌复发转移这一死亡原因的分子机制研究并不清楚，前期实验中，本研究组利用基因芯片发现mRNA NEK2在原发性肝癌组织中表达明显升高（文章待发），因此，本研究拟通过小RNA干扰技术，探讨NEK2对肝癌细胞株HepG2侵袭迁移的影响及作用机制的研究。

1　对象与方法

1.1肝癌细胞及主要试剂

由武汉大学人民医院中心实验室提供HepG2、Huh7、SMMC、7402人肝癌细胞株及正常细胞株LO2。从美国Hyclone公司购买胎牛血清、DMEM培养基及胰蛋白酶EDTA；脂质体（LipofectaminerM2000）及Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBRRPremix ExTaqTMI均购自Takara公司，GAPDH抗体、MMP2、MMP9、TIMP-1抗体、羊抗兔多克隆抗体等蛋白质印记法所用相关抗体购自Abcam公司，NEK2及GAPDH引物序列均由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计合成，NEK2上游引物序为5'-TGTCAGAAGATTCGGAGGAA-3'，下游引物序列为5'-TAACGGACGATGTTTGGATG-3'；GAPDH上游引物序列为5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物序列为5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。根据NEK2的基因序列，实验所需的3条NEK2-siRNA序列及阴性对照siRNA序列 （将目的siRNA序列打乱后重新组合所得的阴性对照组）均由广州市锐博生物科技有限公司设计并合成。针对NEK2的靶序列如下：

表1　设计的NEK2引物序列

1.2实验方法

1.2.1肝癌细胞培养及转染 HepG2细胞从-70℃低温冰箱复苏后，用含10%FBS的高塘培养基，置于37℃、5%CO2适宜条件下培养。取指数生长期HepG2细胞用胰蛋白酶消化，离心制成细胞悬液，以40%～50%接种于6孔板，培养过夜待细胞长到70%～80%后进行转染。SiRNA制备：245μL无血清无双抗的高糖培养液稀释5μL的siRNA，轻轻混匀，室温静置5 min；转染试剂制备：245μL无血清无双抗的高糖培养液稀释5μL的Lipofectamine2000，轻轻混匀，室温静置5min。然后将两种液体混匀，总体积500μL，室温下静止20～30min。吸尽培养板中的培养基，PBS清洗，每孔加入1500μL无血清无双抗的高糖培养基，再加入500μL siRNA/Lipofectamine 2000的混合物每孔，轻轻晃动培养板，充分混匀，4～6 h后更换成含10%FBS的DMEM培养基，培养至48 h，用胰蛋白酶消化采集细胞，继续下一步实验。在转染48 h后细胞提取总RNA，对总RNA进行反转录，转染效率的检测采用实时定量PCR。将实验分为3组：转染siRNA的HepG2细胞为干扰组，转染无义序列的HepG2细胞为阴性对照组，未经任何处理的HepG2细胞为空白对照组。

1.2.2Rea l-t ime PCR检测NEK2 mRNA的表达 待HepG2细胞转染至48 h，按照RNA提取的步骤进行NEK2 RNA的提取，并用紫外线分光光度计检测其浓度与纯度，然后进行逆转录。使用Applied Biosystems@7500 real-time PCR Systems荧光定量PCR仪检测NEK2基因的表达，反应体系：SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，DyeⅡ0.4μL，上游引物及下游引物0.8μL，无酶水（RNase Free H2O）7μL，每孔共20μL，每组设3个复孔。反应条件：95℃10min，95℃15 s，53℃30 s，72℃30 s，共40个循环，根据SDS软件分析数据，计算 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的引物-Ct内参引物），以 2-ΔΔCt分析NEK2mRNA的相对表达量。每个样本在相同条件下重复3次。

1.2.3细胞迁移实验采用24孔Transwell小室进行实验，孔径为8.0μm。在24孔板下室中加入含10% FBS的DMEM培养基600μL。转染24 h后消化收集细胞，用PBS洗3次，用无血清无双抗的DMEM培养基重悬细胞，在小室内加入200μL细胞悬液，细胞密度为1×105/mL，于37℃、5%CO2培养24 h。拿出Transwell小室，用棉球擦掉未穿过微孔膜的HepG2细胞，PBS洗后用4%预冷多聚甲醛固定10 min，DAPI避光染色5 min，在200倍倒置显微镜下计数滤膜下表面的细胞数，随机计数10个视野中的细胞数目，每个标本重复3次。

1.2.4细胞侵袭实验同样采用孔径为8.0μm 24孔Transwell小室进行实验，与细胞迁移实验区别的是，需要提前预冷实验所需Matrigel胶、枪头及离心管等，用预冷的无血清无双抗培养基按1∶6的体积比稀释Martrigel胶，取50μL铺在预冷的Transwell小室底部膜的表面上，37℃孵育2 h使Matrigel胶凝固。消化收集转染后24 h的细胞，PBS洗3次，消化后用无血清无双抗的高糖培养基重悬细胞，使细胞密度为1×105/mL，取200μL细胞悬液加入小室，将600μL含10%FBS的高糖培养基加在24孔板下室，于37℃、5%CO2培养24 h。拿出小室，用棉球擦掉未穿过微孔膜的HepG2细胞，PBS洗后用4%预冷多聚甲醛固定10min，DAPI避光染色5min，在200倍倒置显微镜下计数滤膜下表面的细胞数，随机计数10个视野中的细胞数目，每个标本重复3次。

1.2.5蛋白质印迹法检测干扰后相关蛋白的表达siRNA转染HepG2细胞48 h后，加入蛋白裂解液冰上裂解5 min，冷冻离心提取蛋白，进行定量，经BCA法检测蛋白浓度。将每个蛋白样品40μg加样后进行8%SDS-PAGE电泳，转移至PDVF膜上，在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1 h后，然后TBST洗3次，每次10min。分别加入一抗：NEK2一抗（1∶1000稀释）、MMP2一抗（1∶1000稀释）、TIMP-1一抗（1∶2000稀释）、MMP9一抗（1∶1000稀释）、GAPDH一抗（1∶10 000稀释）4℃温育过夜。次日TBST洗3次，再与稀释1∶10 000羊抗鼠多克隆二抗作用30min，TBST洗3次。最后用ECL显影液化学发光显影，AlphaEaseFC凝胶图像软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝癌细胞系中NEK2水平的测定

在4种人肝癌细胞株HepG2、Huh7、SMMC、7402及正常细胞株LO2中利用Real-time PCR检测NEK2的表达量，结果可知：在LO2、Huh7、SMMC、HepG2、7402这5种细胞株中，NEK2的表达量在HepG2细胞中最高，与LO2细胞比较差异有统计学意义 （P＜0.01）（图1A）。Western blot同样在5种细胞株中检测了NEK2的表达量，发现HepG2细胞中NEK2的表达量也是最高（P＜0.01）（图1B），与Real-time PCR的检测结果一致。因此，选取表达量最高的HepG2细胞作为后续实验对象。

图1　肝癌细胞及正常细胞中NEK2的表达

2.2细胞转染效果观察

2.2.1Rea l-t ime PCR检测转染后HepG2细胞中NEK2 mRNA的表达量采用Real-time PCR技术检测转染后HepG2细胞中NEK2 mRNA的表达量，检测结果提示：在转染NEK2-siRNA后，HepG2细胞中NEK2的表达量较空白对照组及阴性对照组明显降低，尤其是NEK2-siRNA-2组的NEK2表达量最低，差异均有高度统计学意义 （P＜0.01）（图2A）。提示siRNA干扰NEK2的效率较高，能显著降低HepG2细胞中NEK2的表达水平。

图2　分别转染三条干扰序列后HepG2细胞中NEK2的表达

2.2.2Wes te rn b l ot检测转染后HepG2细胞中NEK2蛋白的表达量采用Western blot同样检测在转染48 h后HepG2细胞中NEK2的表达量，其结果提示，将灰度值扫描分析，NEK2在转染组中的表达量空白对照组及阴性对照组明显降低，其中在NEK2-siRNA-2组的NEK2表达量最低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2B）。根据Real-time PCR与Western blot的检测结果可以看出，NEK2-siRNA序列2的转染效果最好，能最大程度地抑制HepG2细胞中NEK2表达。因此，本研究挑选NEK2-siRNA-2序列为干扰序列。

2.3 siRNA干扰NEK2后对HepG2细胞迁移侵袭能力的影响及其机制

为了探讨NEK2对肝癌细胞侵袭转移的影响，本研究分别进行了铺或不铺Matrigel胶的Transwell实验。转染NEK2-siRNA 48 h后，细胞迁移实验显示：干扰组、空白对照组、阴性对照组穿过微孔膜细胞数分别为 （99.5±7.07）、（415.00±6.36）、（411.75±9.9），与空白对照组及阴性对照组比较，干扰组中HepG2细胞的迁移能力降低较为显著，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）（图3A：a～c；B：a）。提示NEK2基因对HepG2细胞的迁移具有促进作用。

转染NEK2-siRNA 48 h后，细胞侵袭实验结果显示，干扰组、空白对照组、阴性对照组穿过微孔膜细胞数分别为（38.50±3.54）、（220.50±6.40）、（219.75±3.54），与空白对照组及阴性对照组比较，干扰组中HepG2细胞的侵袭能力下降较为显著，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）（图3A：d～f；B：b）。提示NEK2基因对肝癌细胞的侵袭也具有促进作用。

为进一步说明NEK2对HepG2细胞迁移及侵袭的具体影响，后续还观察了迁移侵袭相关因子蛋白水平的变化，Western blot及蛋白定量分析显示抑制NEK2的表达后，对侵袭转移具有促进作用的蛋白MMP2及MMP9表达下调，而抑制转移的相关蛋白TIMP-1表达则上调，与空白对照组及阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3C）。说明抑制NEK2的表达后，MMP2及MMP9蛋白表达水平明显下调，TIMP-1蛋白的表达则上调，这二者的共同作用导致了HepG2细胞的迁移侵袭能力的显著降低。

图3　转染NEK2-siRNA-2序列后HepG2细胞迁移侵袭的影响及其相关蛋白因子的变化

3　讨论

NEK2是一类丝氨酸-苏氨酸激酶，是重要的中心体蛋白，参与细胞周期调控，是细胞周期调控蛋白激酶家族成员之一［5］。有研究发现，NEK2高表达于乳腺癌［6-7］、卵巢癌［8］、结肠癌［9］、骨髓瘤［10］的细胞系中，对肿瘤的发生、发展及不良预后均有促进作用。体外研究也表明，干扰NEK2基因能增强化疗对癌细胞增殖的抑制，并促进其凋亡［11］。

为了探讨NEK2的表达是否对肝癌细胞HepG2也有影响，本研究采用siRNA技术干扰NEK2表达后观察其对HepG2细胞迁移侵袭及其相关机制的影响。实验结果提示，Real-time PCR及Western blot检测证实转染效果较成功，能有效地降低干扰组NEK2的表达水平。早期研究结果表明［12-13］，通过siRNA技术发现下调NEK2的表达后，肿瘤的侵袭及转移能力降低甚为明显。基于此，本研究利用Transwell小室观察转染后HepG2细胞的迁移及侵袭能力的改变。Transwell结果显示干扰组中穿过微孔膜的细胞数量明显比空白对照及阴性对照少，提示对NEK2基因功能进行抑制后，HepG2细胞的迁移及侵袭能力被抑制。

侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征，也是其复发和致死的主要原因［14］，而据我们所知，恶性肿瘤的有着复杂的侵袭转移的机制，大致可归纳为以下几种：

①肿瘤细胞之间黏附性降低；②肿瘤细胞的黏附性增加，与细胞外基质不易分离；③肿瘤细胞产生蛋白水解酶降解细胞外基质及血管基底膜，侵犯进入血管或淋巴管内，癌细胞可在远处增殖形成转移灶［15］。金属蛋白酶是一组具有降解细胞外基质和血管基底膜能力的蛋白酶，对多种肿瘤细胞的侵袭和转移起促进作用［16］。其中MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成员，能溶解基底膜的重要组成部分Ⅳ胶原［17］，对恶性肿瘤的侵袭转移起着正向调控作用［18］。而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是一类能与MMPs形成复合物，阻止MMPs的水解基底膜作用的分子家族，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四个分子［19］。基于此，本研究进一步检测转染后侵袭相关蛋白的变化：Western blot结果提示，沉默NEK2的表达后，干扰组HepG2细胞中的MMP2、MMP9的表达降低，TIMP-1的表达则升高。从分子水平说明NEK2对HepG2迁移及侵袭的调控是通过上调MMP2、MMP9，下调TIMP-1实现的。因此，可推测NEK2基因在促进HepG2细胞迁移侵袭中有着正向调控作用，NEK2可能通过上调MMP9及MMP2，下调TIMP-1调控细胞的侵袭转移。

Kokuryo等［20］利用siRNA技术对种植于裸鼠体内的胆管上皮癌细胞进行NEK2基因沉默，发现胆管上皮癌的腹膜播散受到明显抑制。Tsunoda等［12］也用siRNA干扰乳腺癌细胞株中NEK2基因的表达后，乳腺癌细胞的侵袭能力也明显减低。本实验结果与国外研究者在胆管癌和乳腺癌上关于NEK2对恶性肿瘤侵袭转移的作用一致，这可证实NEK2对肝癌细胞的侵袭转移确实起促进作用。

综上所述，本研究通过siRNA靶向干扰HepG2细胞中NEK2表达后，可以有效降低该细胞的迁移及侵袭能力。

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Effects of NEK 2 on migration and invasion of HepG2 in hepatoma cells and the related mechanism

ZHANG Dongqiang XU Ximing▲ZHANGMeixia
Cancer Center，Renmin Hospital ofWuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R735.7

A

1673-7210（2016）09（b）-0013-05

2016-05-05本文编辑：任念）

湖北省自然科学基金项目（2012FKC14301）。

张东强（1969.11-），男，武汉大学第一临床学院2013级肿瘤专业在读硕士研究生；研究方向：消化道肿瘤。