离子色谱-串联质谱法分析环境水体中痕量人工甜味剂

桂建业　孙　威　张辰凌　张永涛　张　莉　刘　菲*(中国地质科学院水文地质环境地质研究所，正定050803)(中国地质大学(北京)，水资源与环境学院，北京00083)

离子色谱-串联质谱法分析环境水体中痕量人工甜味剂

桂建业1，2孙威2张辰凌1张永涛1张莉1刘菲*2
1(中国地质科学院水文地质环境地质研究所，正定050803)2(中国地质大学(北京)，水资源与环境学院，北京100083)

人工甜味剂被广泛使用并且在环境中持久存在，因此可能成为生活废水污染地表水体及地下水的有力证据。人工甜味剂作为一种新型示踪剂，对其在环境水体中的分析方法的灵敏度和抗干扰能力提出了更高的挑战。本研究采用离子色谱-三重四极杆串联质谱负离子模式实现了4种人工甜味剂的分离检测。经对比考察，采用细内径(2mm)离子色谱柱(AS19-2 mm)既缩短了保留时间又提高了分离度;采用60 mmol/L NaOH等度洗脱，既实现了简便操作，又克服了传统的反相分离试剂及缓冲盐对离子化效度的负面影响;采用默克固相萃取柱(Merk LiChrolut EN 200 mg 3 mL)对酸化水样(pH＜2．0)进行富集，固相萃取柱活化条件为依次加入2 mL甲醇与2 mL水，并采用2 mL甲醇;采用外接水柱后抑制法进一步提高了灵敏度、降低了检测背景值，抑制器电流为75mA;统一采用多反应监测负离子模式实现了安赛蜜、糖精钠、甜蜜素及三氯蔗糖4种人工甜味剂的同时采集与检测，检出限均在5．0 ng/L以下，不同基质环境样品的加标回收率可控制在65%～120%之间。本方法简便、干扰少、检出限低，既适合于不同基质环境水样的日常分析监测，又适合于地下水污染的示踪研究。

人工甜味剂;示踪剂;离子色谱-串联质谱;地下水

1　引言

人工甜味剂是一类广泛被用来替代蔗糖的低能量添加剂，常被用在食品、饮料、药品以及诸多卫生产品上，这类甜味剂包括安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖、甜蜜素、纽甜、阿斯巴甜等，其中前4种在我国使用最为普遍。由于人工甜味剂毒理性很弱，因此对其环境行为研究很少。自Buerge等发现其在环境中难以降解，并且会随着废水的排放进入各种环境受体以来，其作为生活废水环境示踪剂的作用日益受到关注和重视［1，2］，一些文献报道了其作为示踪剂的可靠性［3］，有的研究者尝试将人工甜味剂与其它示踪剂一起，联合对生活污水进行示踪［4］。

当前，人工甜味剂较为成熟的测试方法包括高效液相色谱法［5，6］、傅立叶变换拉曼光谱法［7］、气相色谱-质谱法［8］、液相色谱-质谱联用法［9］等。这些方法已经足够满足其在食品饮料中的分析要求，但是对于环境样品分析却不够满意，因为环境样品中人工甜味剂的含量很低，多处于痕量乃至超痕量水平，并且环境样品基质各不相同，分析检测难度大，定量分析困难。

目前，环境样品中痕量人工甜味剂的分析主要采用液相色谱-三重四极杆串联质谱法。Scheurer等［10］建立了反相液相色谱分离、柱后添加改进剂(三羟甲基氨基甲烷，Tris)的串联质谱方法，Gan等［11］改进了该方法，将改进剂Tris直接加入到流动相中，使其作为离子对试剂来改善分离，并且在固相萃取的过程也引入Tris，用于提高萃取效率。类似方法了有报道［12，13］，但只是采用了不同的或者性能更高的质谱仪来完成多反应监测。Wu等［14］采用监测加合离子［M+HCOO］-的办法使三氯蔗糖的灵敏度提高了20倍，实现了地下水样品的大体积进样直接分析。与其它类目标物(如药品与护肤品、内分泌干扰物等)同时分析的方法也陆续被开发［15，16］，但均是采用反相分离串联质谱检测的方法，这些方法都存在着灵敏度不高、分离困难等问题，因为这些方法都要借助梯度洗脱并且添加改进剂才能实现分离，然而在添加改进剂的同时又会给后续的质谱检测带来负面影响。

本实验系统研究了离子色谱-三重四极杆质谱多反应监测分析方法，利用简单有效的条件解决分离与检测的矛盾，并试图研发配套的基于聚合物填料的新型固相萃取方法，有效解决多种基质水样中人工甜味剂的筛选与分析方法，为地下水污染示踪提供可靠手段。

2　实验部分

2．1仪器与试剂

ICS-1500离子色谱仪(美国戴安公司);3200-QTRAP三重四极杆线性离子阱串联杂交质谱仪(美国AB公司);MTN-2800W氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);HA-20固相萃取仪(天津市恒奥科技发展有限公司);AS11HC-4mm，AS17HC-4mm AS19-4mm，AS19-2mm离子色谱柱(美国戴安公司); ASRS 300抑制器(美国戴安公司);Phenomenex Fusion-RP C18液相色谱柱(广州菲罗门科学仪器有限公司);Shim-pack VP-ODS液相色谱柱(日本岛津公司)。

固相萃取柱:Supelco ENVI-18(色谱科500 mg/6 mL)，Varian，Bond Elut-C18(瓦里安，500 mg/ 6 mL)，Agilent C18Sample Pack(安捷伦，500 mg/6 mL)，Oasis HLB Cartridge(沃特世，3 mL/60 mg)，Merk LiChrolut EN 200(默克，mg/3 mL)，Poly-sery PSD(德国CNW，200 mg/3 mL)。

标准品:三氯蔗糖、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素(百灵威公司);内标物:三氯蔗糖D6、安赛蜜D4(百灵威公司);甲醇、乙腈(德国Merk公司);无水Na2SO4、H3PO4(优级纯)，NaOH(优级纯)购自国药集团试剂有限公司;纯水取自Milli-RO Plus超纯水系统(Millipore公司)。

2．2样品预处理

取200mL水样，加入约3mLH3PO4(V(H3PO4)∶V(H2O)=1∶2)，摇匀，使pH＜2．0。先后用2mL甲醇与2 mL水对Merk小柱进行活化，将小柱装入固相萃取装置，连接大体积采样管，使酸化好的样品以4 mL/min的速度上样，再以2 mL甲醇洗脱，用氮吹仪吹至近干，加入内标10μL(1．0 mg/L三氯蔗糖D6及安赛蜜D4混合液)，以水定容至1 mL，待测。

2．3色谱-质谱条件

离子色谱柱AS19-2mm，60 mmol/L NaOH等度洗脱，流速0．3 mL/min，抑制器采用外接水模式，外接水流量0．8 mL/min，抑制电流75 mA，电喷雾电离源监测方式为负离子多反应监测模式，离子喷雾电压-3500 V，离子源温度600℃，碰撞气压力(CAD)83 kPa，气帘气压力(CUR)172 kPa，GAS1 350 kPa，GS2 450 kPa，其它离子碎片参数见表1。

表1　串联质谱监测条件Table 1　Condition of tandem mass spectrometry

3　结果与讨论

3．1人工甜味剂的性质及分离方式的选择

大多数人工甜味剂含有羟基、磺酸基或磺酰基，这些强亲水性的极性基团都会导致这些化合物在水中以离子形式存在，即水中溶解度极大，这一性质也决定了人工甜味剂一旦进到受体环境后，会随着水体迁移非常远距离，部分人工甜味剂在环境中稳定性较好，因此可以作为环境的示踪剂。

由于人工甜味剂的高亲水性使得其在常规的基于反相机理的液相色谱柱上保留非常弱，甚至不保留，这给色谱分离带来了很大困难。人工甜味剂均属于带负电物质，在流动相中加入一定比例的酸会增强其在反相色谱柱上的保留，但是酸的加入会严重抑制负离子在电喷雾上的信号强度，这就使分离与检测形成了一对不可调和的矛盾。离子对试剂也可以用来改善分离，但是流动相中加入离子对试剂会使平衡时间变得很长，并且离子对试剂也会使部分物质(如三氯蔗糖)在电喷雾上的信号变弱［10］。某些特殊处理的反相色谱柱在一定条件下也可以使人工甜味剂的保留有所增强，但也必须通过加入缓冲盐，或者改进剂，并且通过梯度洗脱方能实现［11］。

离子色谱分离是根据离子价态和疏水性吸附程度进行色谱分配的一种分离方式，由于人工甜味剂在水中以离子形式出现，并且疏水性和价态不一，因此理论上可以采用离子色谱柱进行分离。本研究分别采用AS11HC、AS17HC及AS19色谱柱进行实验，发现多种离子色谱柱均有分离人工甜味剂的能力，但分离性能和分离时间差别非常大，AS11HC是高容量的阴离子分离柱，适用于分析复杂样品基质中大量的无机阴离子和有机酸，但是在分离人工甜味剂时，保留时间需要30 min以上，并且需要NaOH浓度大于70 mmol/L，这给后面抑制器工作造成很大的负荷;AS17HC及AS19均可以在梯度条件下20 min内完全分离4种人工甜味剂，峰对称性好，但半峰宽较大，以上实验均是采用4 mm内径的色谱柱完成。理论上，采用2 mm内径的色谱柱可以提高4倍柱效，并且峰宽会变窄，这样可以使灵敏度提高4倍以上，本研究采用AS19-2mm色谱柱进行实验，采用60 mmol/L NaOH进行淋洗，4种甜味剂在9 min内实现完全分离，达到了满意的效果(图1)。

图1　人工甜味剂(10．0μg/L)在AS 19-2mm离子色谱柱上的分离图Fig．1　Chromatogram of artificial sweeteners(ASs，10．0μg/L)in anion chromatography column AS 19-2mm 1．三氯蔗糖(SUC)3．22 min;2．三氯蔗糖-d6(SUC-d6) 3．31 min;3．甜蜜素(CYC)3．58min;4．安赛蜜-d4(ACE-d4) 5．92 min;5．安赛蜜(ACE)5．93 min;6．糖精钠(SAC)8．68 min

3．2萃取方法

由于人工甜味剂特殊的高亲水性，使得在食品及土壤中萃取此物质的最佳溶剂为水或者缓冲盐，而不是有机溶剂［13］。但是从水中将人工甜味剂反萃取非常困难。采用特殊填料(如HLB小柱)可以取得较好的回收率［17］，因为它是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，通过增加特殊极性捕获基团，增强极性有机物的保留，但是，这些材质的保留机理依然为反相萃取，因此在回收率稳定性的控制上对操作者的要求较高。为了研究萃取柱及萃取填料对人工甜味剂的萃取性能，本实验重点考察了LiChrolutEN固相萃取柱(Merk公司)及Poly-sery PSD萃取柱(德国CNW公司)，并将这些萃取柱的性能与Waters Oasis HLB(美国沃特世公司)及另外3种常规反相萃取柱ENVI-18(500 mg/6 mL Supelco公司)、Bond Elut-C18(500 mg/6 mL，Varian公司)、C18Sample Pack(500 mg，6 mL，Agilent公司)进行了比较。实验采用石家庄地下水样品(溶解性共固体为395．0 mg/L)，加标后在各类型固相萃取柱上进行回收实验，加标浓度为50．0 ng/L，每份样品的萃取体积为200 mL，操作方式见2．2节，6种不同萃取柱的萃取回收效果见表2。LiChrolutEN固相萃取柱在萃取人工甜味剂方面性能最好，原因可能在于此萃取柱的填料为苯乙烯二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)，呈不规则形状，其粒径分布为40～120μm，由于其具有非常大的比表面积(约为1200 m2/g)，载量是普通反相C18柱的十几倍，对于极性有机化合物有非常优越的吸附容量。

表2　6种固相萃取小柱的回收率(%)Table 2　Recovery of 6 kinds of solid phase cartridge(%)

3．3质谱条件的优化

串联质谱多反应监测中质谱碎片的选择以及离子化参数优化对于人工甜味剂的分析十分关键，与常规的反相分离的条件不同，离子色谱流动相为强碱(NaOH)，经过抑制器抑制后产物为纯水，与甲醇、乙腈等有机溶剂相比，水对目标物离子化效率的促进作用较弱，对比实验发现，在柱后添加50%乙腈可以将信号强度提高20%～75%，但缺点是操作上需要增加一台计量泵及三通，这样会使日常监测变得复杂。进一步实验发现，提高离子源温度也可以明显提高离子化效率，优化离子源温度发现，在600℃条件下取得了较好的效果。

3．4检出限、线性范围、线性系数及回收率

配制0．5～500．0μg/L的系列浓度加标溶液，采用内标法定量(其中，三氯蔗糖-D6定量三氯蔗糖;安赛蜜-D4定量安赛蜜、甜蜜素和糖精钠)，相关系数可控制在0．997以上(表3);以华北地区地下水为基质，同时添加7个浓度为50．0 ng/L的样品进行加标回收实验，以3倍信噪比计算，除三氯蔗糖外，其余组分检出限可达5．0 ng/L以下。

表3　线性范围、相关系数、回收率、相对标准偏差及方法检出限Table 3　Linearity range，correlation coefficient，recovery，RSD and LOD

3．5不同基质样品加标回收实验及实际样品分析

采用石家庄城市及近郊饮用水、地下水、地表水及生活废水等不同基质样品，分别进行基体加标实验，添加水平分别为20．0，50．0和100．0 ng/L，在不同基质条件下，所有化合物回收率均在65%～120%之内。采用本方法对华北地区地质调查的地下水及地表水等20余组样品进行分析，共有7组有不同浓度的组分检出，检出率高达30%以上(表4)。

表4　实际样品分析结果Table 4　Analytical result of real samples

7组有检出结果的样品中，编号为 HB15B15，HB15B67，HB15B95的样品为地表水;编号为HB15D67，HB15D95，HB15D139和HB15D156的样品为地下水。其中，HB15B67和HB15D67为同一个污水处理厂附近的地表水和地下水样品;HB15B95和HB15D95为同一个生活垃圾填埋厂附近的地表水和地下水。从表7可见，安赛蜜的检出最为普遍，尤其是有对应关系的地表水与地下水相关性较好，其作为示踪剂的稳定性与可靠性较其它3种更有优势;三氯蔗糖也具有较好的潜力，但由于其检出限较其它几种高，可能掩盖了其指示意义;另外两种甜蜜素和糖精钠在地下水中检出率较低，这可能是由于地表水在向地下水渗透的过程中由于土壤的岸滤作用而被吸附或截留的原因。

从当前报道的有限的人工甜味剂环境行为来看，安赛蜜和三氯蔗糖应该是很难被吸附或降解，而糖精和甜蜜素则较容易被吸附、降解或被污水处理厂处理掉［1～3］，因此Buerge等［1］曾经假设:如果在水环境中检测出浓度较低的不易被降解的安赛蜜和三氯蔗糖，而糖精和甜蜜素等易被降解的甜味剂未被检出，则说明该水体受到了被处理过的污水的污染;而如果安赛蜜和三氯蔗糖较高，糖精和甜蜜素较低，则说明该水体曾经被未处理过的污水污染(糖精和甜蜜素被降解了一部分，但还未完全降解，污水可能已经排入受纳水体一定时间);如果糖精和甜蜜素较高，则说明该水体近期被污染(糖精和甜蜜素被降解的程度低，污水可能被排入受纳水体不久)。按照这一推测，HB15B15和HB15B95可能是受了未被处理过的生活污水污染，HB15B67可能是水体近期刚被污染，而HB15D67、HB15D95、HB15D139和HB15D156则可能是被污染处理厂处理过的污水侵入过。本研究认为该假设对于地表水体更加适用，而对于地下水样品，应该结合地层结构、地下水流向以及地层不同粘性对人工甜味剂的吸附降解作用等多种因素进行综合考虑才可以给出明确的答案。

4　结论

本实验系统研究了基于离子色谱分离结合串联质谱进行检测的可行性，优化了质谱参数，详细对比了各种分离机制尤其是基于共聚物的固相萃取小柱与基于反相机理的固相萃取柱之间的差异和优缺点，采用简单的等度条件实现了4种人工甜味剂的分离检测。与已有的方法相比，由于有效利用了离子交换机理使得人工甜味剂在色谱柱上的保留大大增强，从而克服了反相分离保留时间太短易被干扰的情况。利用此方法对实际样品进行了分析。由于本方法简便实用、灵敏度高、回收率好、抗干扰能力强，因此可以有效应对不同基质样品中人工甜味剂的分析监测，从而为采用人工甜味剂示踪生活废水对地表水受体及地下水渗入的影响提供技术，同时也可以为地下水污染的溯源提供有力支撑。

References

1Buerge I J，Buser H R，Kahle M，Müller M D，Poiger T．Environ．Sci．Technol．，2009，43(12):4381－4385

2Buerge I J，Keller M，Buser H R，Müller M D，Poiger T．Environ．Sci．Technol．，2010，45(2):615－621

3Oppenheimer J，Eaton A，Badruzzaman M，Haghani AW，Jacangelo JG．Water Res．，2011，45(13):4019－4027

4Liu Y Y，Blowes DW，Groza L，Sabourin M J，Ptacek C J．Environ．Sci．Proc．Imp．，2014，16(12):2789－2795

5Wasik A，McCourt J，Buchgraber M．J．Chromatogr．A，2007，1157(1-2):187－196

6LIU Li-Min，PENG Jing-Dong．Journal of Instrumental Analysis，2008，27(5):549－552刘丽敏，彭敬东．分析测试学报，2008，27(5):549－552

7Mazurek S，Szostak R．Food Chem．，2011，125(3):1051－1057

8ZHANG Ya-Heng，ZHOUWei，LIBin．Chinese J．Anal．Chem．，2013，41(6):911－916张雅珩，周围，李斌．分析化学，2013，41(6):911－916

9Yang D J，Chen B．J．Agric．Food Chem．，2009，57(8):3022－3027

10Scheurer M，Brauch H J，Lange F T．Anal．Bioanal．Chem．，2009，394(6):1585－1594

11Gan ZW，Sun H W，Wang R N，Feng B T．J．Chromatogr．A，2013，1274:87－96

12Berset JD，Ochsenbein N．Chemosphere，2012，88(5):563－569

13Ordoez E Y，Quintana JB，Rodil R，Cela R．J．Chromatogr．A，2013，1320:10－16

14Wu M H，Qian Y C，Boyd JM，Hrudey SE，Le X C，Li X F．J．Chromatogr．A，2014，1359:156－161

15Tran N H，Hu J，Ong S L．Talanta，2013，113:82－92

16EnsW，Senner F，Gygax B．Schlotterbeck G．Anal．Bioanal．Chem．，2014，406(12):2789－2798

17van Stempvoort D R，Roy JW，Grabuski J，Brown S J，Bickerton G，Sverko E．Sci．Total Environ．，2013，461-462: 348－359

Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．42172252)

An nnovative Approach to Sensitive Artificial Sweeteners Analysis by Ion Chromatography-Trip le Quadrupole Mass Spectrometry

GUIJian-Ye1，2，SUNWei2，ZHANG Chen-Ling1，ZHANG Yong-Tao1，ZHANG Li1，LIU Fei*2
1(Institute of Hydrogeology and Environmental Geology，Chinese Academy of Geological Sciences，Zhengding 050803，China)2(School ofWater Resources and Environment，China University of Geoscience，Beijing 100083，China)

Artificial sweeteners(ASs)have gained more and more attention by environmental scientists because some of them such as acesulfame，have the potential to be the ideal tracers of domestic wastewater for environmentalmonitoring．In contrast to the existingmethods of artificial sweeteners，the analyticalmethod of ASs as a new tracer for environmental samples requires better sensitivity and selectivity to avoid matrix interference．A highly sensitive method for the simultaneous determination of four frequently-used artificial sweeteners in water samples using solid-phase extraction and ion chromatography triple quadrupole mass spectrometer with an electrospray ionization source(IC-MS/MS)in negative ion mode was developed．The separation effect of different separation columns was compared and a 2-mm ion chromatography column AS19 was chosen in the experiment．Chromatographic separation of all the 4 artificial sweeteners was carried out in 9 min in isocratic elution mode using 60 mmol/L sodium hydroxide as eluent．Different kinds of solid phase extraction cartridgeswere evaluated to obtain satisfactory recoveries of all of the analytes．Merk LiChrolut EN (200 mg，3 mL)was preconditioned with 2 mL ofmethanol，followed by 2 mL of H2O．About 200 mL of sample(pH＜2．0)was passed through the cartridge at a flow rate of 4 mL/min，and then the cartridge was eluted using 2 mL ofmethanol．2 mm suppresser(75 mA)was used to reduce the background noise and to remove thematrix interference．The limits of detection were below 5．0 ng/L for various artificial sweeteners based on 3-fold the S/N．The recoveries of differentmatrices in the samples were 65%－120%．The method described here is time-saving，accurate and precise，and is suitable for monitoring artificial sweeteners in differentwatermatrices．Themethod has also the potential to trace other contaminants in groundwater．

Artificial sweeteners;Tracer，Ionchromatography-triple quadrupole mass spectrometry; Groundwater

28 August 2015;accepted 4 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150689

2015-08-28收稿;2015-12-04接受

本文系国家自然科学基金项目(No．42172252)资助

*E-Mail:Agui_mail@163．com;