酱香型大曲中分离到的阿姆斯特丹散囊菌产酶产香特性

王晓丹，徐 佳，周鸿翔，班世栋，邱树毅,*（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 55005；.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 55005）

酱香型大曲中分离到的阿姆斯特丹散囊菌产酶产香特性

王晓丹1,2，徐 佳2，周鸿翔2，班世栋2，邱树毅1,2,*
（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

为了探究酱香型大曲中霉菌的种类及其功能，采用稀释平板涂布法从遵义地区的6 个企业的酱香型大曲中分离筛选霉菌菌株，结合形态观察和真菌rDNA-ITS基因序列同源性比对进行分析。在其中5 个企业的大曲样品中 均能筛选分离得到一株散囊菌，归类并命名为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus）。以茅台大曲筛选的阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）为研究对象，该菌株产糖化型淀粉酶活力最高，达到（3 100.16±109.43） U/g，酸性蛋白酶活力为（225.69±2.69） U/g、果胶酶活力为（435.88±68.49） U/g、脂肪酶与纤维素酶活力分别为（13.56±1.73） U/g和（4.14±0.16） U/g。采用固相微萃取-气质联用技术对固态发酵的挥发性香味物质进行结果分析，该菌固态发酵具有很强花香和果蔬香，挥发性香味物质以高级醇、酮和呋喃类为主，其中L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-戊基呋喃的相对含量较高，分别为挥发性物质的16.37%、41.23%、6.95%、6.75%。分离得到的这株阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）是一株产多种酶并同时产多种香气成分的霉菌，是酱香大曲微生物组成中的重要霉菌之一。

酱香大曲；阿姆斯特丹散囊菌；酶活力；香气成分

在中国，固态发酵一般使用霉菌作为规模生产用菌，例如利用从传统酒曲中筛选获得的根霉发酵生产酒精，以及根霉纯种曲应用于白酒生产以提高出酒率等[1]，也有利用曲霉为发酵菌种，以白酒渣、香菇残渣为发酵培养基质生产具有抗病作用的饲料[2]。因此从白酒大曲中筛选出的功能霉菌应用于白酒生产及副产品的开发利用具有重要意义。研究表明，霉菌在酿酒过程中具有产酶[3]、产香[4-5]、产色素[6]等多种功能。邓皖玉等[4]从郎酒大曲中分离得到3 株霉菌，通过理化特性并结合感官评定及挥发性物质的检测，确定编号为C05的菌株可产具有硫香的酱味；蒋英丽等[5]从郎酒大曲中分离得到的霉菌经过香气成分分析，确定地霉属、木霉属、根霉属、红曲霉属能为酱香型白酒独特风味的形成提供果香。霉菌是酿酒生产前期发酵原料中淀粉、蛋白质等大分子物质降解的主要动力[7]，在霉菌产生的丰富酶系中，糖化酶和蛋白酶是霉菌主要分泌的酶，它们对酿造原料具有良好的降解功能，分解后的产物可被其他微生物利用，对产酒具有积极的促进作用；同时在生长代谢过程中还产生一些呈香物质，组成白酒独特的风味。

本实验的茅台酒酿造用大曲，每克中的霉菌数量多达105个，种类丰富的霉菌可通过大曲进入酿造体系发挥作用[8]。目前通过可培养方式，从酱香大曲中分离得到的霉菌主要集中在7 个属：Mucor、Rhizopus、Absidia、Aspergillus、Penicillium、Paecilomyces和Monascus[9-11]，其中Aspergillus、Rhizopus、Penicillium、Paecilomyces参与了酱香白酒的整个生产过程，是实现同步糖化发酵生产酒的关键微生物[9]。但是，以前的研究表明，对不同酱香大曲中分离筛选霉菌的液化酶、糖化酶和蛋白酶活力进行测定，发现各菌株之间酶活性相差较大[3,12]。因此，本实验进一步对酶活力都较高的菌株进行了再分离筛选和鉴定，考察其产酶和产香功能，以期获得功能性霉菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

1.1.1 材料

茅台大曲来源于贵州茅台酒股份有限公司茅台酒生产车间的生产用曲。产地位于黔北遵义地区赤水河畔的茅台镇（106°22′E， 27°51′N，海拔423 m）。

茅台异地大曲来源于贵州珍酒酿酒有限公司珍酒酿造车间的生产用曲。产地位于贵州省遵义市北郊十字铺（106°54′E、27°44′N，海拔933 m）。这里地形与茅台酒厂所在地十分相似，年平均气温、湿度等也比较相近。

茅台镇1、2、3、4大曲，产地位于黔北遵义地区赤水河畔的茅台镇其他酒企业，与贵州茅台酒股份有限公司直线距离300～500 m。

采集样品为贮存6 个月的陈曲，生产车间使用粉碎待用。样品产地为贵州遵义地区，尤其是茅台镇域内是“世界酱香型白酒主产区”、“中国酒都核心区”，这里生产的贵州茅台酒是大曲酱香型白酒的鼻祖，拥有悠久的历史。

1.1.2 试剂

植物基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；其他试剂为市售分析纯。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）、查氏培养基（czapek dox agar，CA）、麦芽汁琼脂培养基（malt extract agar，MEA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose broth，PDB），均购于上海博威科技有限公司。

20%蔗糖查氏琼脂培养基[13]（g）：蔗糖20、NaNO30.2、K2HPO40.1、KCl 0.05、MgSO4·7H2O 0.05、FeSO40.001、琼脂2、溶于100 mL水，121 ℃灭菌20 min。

麸皮培养基：麸皮15 g，加入15 mL水，搅拌均匀，121 ℃灭菌20 min。

高粱小麦固体发酵培养基[14]：分别称取高粱与小麦各15 g，分别加入10 mL水，搅拌均匀，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

YS100光学显微镜 南京江南永新光学有限公司；S-3400N扫描电镜 日立公司、UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；手动固相微萃取装置 美国Supelco公司；HP6890/5975C GC/MS联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的分离纯化

称取10 g大曲溶于加有玻璃珠的90 mL无菌生理盐水中，充分振荡30 min，梯度稀释10－2、10－3、10－4、10－5，进行平板涂布计数。选择菌落数在30～300 个的平板中霉菌进行划线分离纯化，将纯化菌种转接斜面，编号保存。

1.3.2 霉菌的鉴定

1.3.2.1 霉菌的形态学鉴定

将已经分离纯化的菌株分别点植到PDA、CA、MEA培养基上，25 ℃培养箱中培养5～20 d，观察菌落的形态特征，挑取少量菌体染色处理后，制片在光学显微镜下观察菌丝及其孢子形态特征，通过《中国真菌志》[13]对其进行形态学鉴定。

1.3.2.2 霉菌的分子生物学鉴定

将分离纯化的霉菌接种到PDB中，30 ℃条件下在摇床培养5～7 d，收集菌丝球，用植物DNA基因组试剂盒提取DNA。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增采用真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS4和ITS5。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成，并将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库中进行比对。1.3.2.3 菌株FBKL3.0120的形态学鉴定

将已纯化的菌株分别点植到CA和20%蔗糖查氏琼脂培养基上，25 ℃培养20 d左右，观察菌落的形态特征，挑取少量菌体做前处理后，制片在S-3400N扫描电镜下观察菌丝及其孢子形态特征，通过《中国真菌志》[13]对其进行形态学鉴定。

1.3.3 阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）粗酶液的制备及酶活力测定

1.3.3.1 粗酶液的制备

将菌株接种到PDA斜面上30 ℃培养7 d，用无菌水洗孢子后，以0.1 mL/g的接种量接种到麸皮培养基中，30 ℃培养3 d，所得培养物与水按照m（培养物）∶V（水）＝1∶10的比例混合搅匀，40 ℃水浴1 h，每隔15 min搅拌1 次，过滤，所得滤液为粗酶液。

1.3.3.2 阿姆斯特丹散囊菌的酶活力测定

糖化型淀粉酶与纤维素酶活力的测定采用二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[15-16]；酸性蛋白酶活力的测定根据SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》进行测定。脂肪酶活力的测定根据GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》，采用国标动态滴定法进行测定。果胶酶活力的测定根据QB 1502—1992《食品添加剂 果胶酶制剂》，采用国标果胶酶制剂测定法进行测定。

1.3.4 阿姆斯特丹散囊菌固态发酵物的香气成分的测定

取培养7 d的FBKL3.0002斜面试管一支，用10 mL的无菌水清洗，然后以10%的接种量接入高粱与小麦固体发酵培养基中，30 ℃培养7～9 d。均匀取样品约10 g，置于50 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入手动进样器，在120 ℃左右顶空萃取40 min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250 ℃）中，热解析3 min后进样。色谱条件：色谱柱为ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温40 ℃，保留2min，以5 ℃/min的升温速率升至270 ℃，运行时间：48 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压52.53 kPa，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1 min。质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 294 V；接口温度280 ℃；分子质量范围20～450 D。

2 结果与分析

2.1 霉菌的分离筛选及鉴定

采用常规的平板涂布分离方法，根据霉菌在培养基上以及显微镜下的不同形态特征，从6 种酱香大曲中共分离纯化得到多株霉菌。通过对rDNA-ITS区域测序并在NCBI比对鉴定，所有得到的菌株可以被划分为9 个属，即犁头霉属（Absidia）、毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、拟青霉属（Paecilomyces）、红曲霉属（Monascus）、散囊菌属（Eurotium）、Thermoascus，已保藏于贵州大学发酵重点实验室。犁头霉属、毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、拟青霉属、红曲霉属、Thermoascus作为高温大曲中常见的霉菌属，对其功能研究已有很多，然而对散囊菌尤其是茅台大曲，并没有对其功能性的详细报道，因此，其作为可分离筛选的微生物来说，是值得研究的。

2.2 阿姆斯特丹散囊菌的形态学特征

通过平板划线分离，按照《中国真菌志》[13]的形态观察培养方法，将得到的散囊菌菌株点植在CA和20%蔗糖查氏琼脂培养基上观察其菌落形态。收集培养所得的菌体，经清洗、固定等处理后制片，进行电镜扫描。发现分离得到的散囊菌属霉菌分别为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和冠突散囊菌（Eurotium cristatum），其中冠突散囊菌只在茅台大曲中发现，阿姆斯特丹散囊菌除在茅台镇2大曲没有分离到，在其余的5 个大曲中均有分离得到，并且采用常规的平板涂布分离法，能较容易分离得到。

表1 6 个大曲中散囊菌属霉菌的分离结果Table 1 Numbering of Euroottiiuumm isolated from 6 Daqu samples

阿姆斯特丹散囊菌在CA培养基上生长缓慢，25 ℃ 12～14 d菌落直径27～30 mm，菌落表面平坦，分生孢子结构与闭囊壳混在，闭囊壳亮黄色，菌落反面黄色（图1a）。菌落在20%蔗糖查氏琼脂培养基上生长较快，其菌落形态与CA培养基上相同。分生孢子梗直立、光滑（图1b）；分生孢子头辐射形，顶囊烧瓶形，直径16～25 μm，产孢结构单层（图1c）；分生孢子球形，近球形，4～6 μm，少数椭圆形（5～6.5） μm×（3～5） μm，壁具有小刺（图1d）；闭囊壳球形或近球形，直径80～170 μm，裸露，亮黄色（图1e）；子囊孢子双凸镜形，（4.5～5.5） μm×（3.6～4.5） μm，两瓣中间有沟及两个不规则的脊，凸面有不规则的粗糙（图1f）。观察到的这些主要特征与《中国真菌志》[13]上描述的形态特征完全吻合，从形态学特征上可以鉴定为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）。

图1 阿姆斯特丹散囊菌形态特征Fig. 1 Morphological characteristics of Eurotium amstelodami

2.3 阿姆斯特丹散囊菌的分子生物学鉴定

菌株FBKL3.0107、FBKL3.0120、FBKL3.0134、FBKL3.0174、FBKL3.0185的智能交通系统（internal transcribed spacer，ITS）区域PCR扩增产物测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，并构建系统发育树（图2）。以上5 个菌株的ITS片段为523 bp，与数据库中的Eurotium amstelodami（KF031322）相似度为99%，且与Eurotium amstelodami处于同一分支。因此进一步证实为阿姆斯特丹散囊菌。

班世栋等[3]在研究筛选酱香型白酒大曲中产酶霉菌时，不仅对该菌进行鉴定，还对该菌进行了酶活力的测定。其结果表明，在筛选到的19 株霉菌中，该菌的综合产酶能力是最强的。本实验以茅台大曲筛选的菌株FBKL3.0120为研究对象，对其在酿造过程中的功能做进一步研究。

图2 5 种阿姆斯特丹散囊菌菌株的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree for the strains FBKL3.0107, FBKL3.0120, FBKL3.0134, FBKL3.0174 and FBKL3.0185

2.4 阿姆斯特丹散囊菌的产酶特性

酱香大曲的酶系主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶、酯化酶、漆酶等酶类[17]。实验对阿姆斯特丹散囊菌在酿造过程中所产的5 种代表性酶的活性进行了研究，其结果如表2所示。各种酶的酶活力差异较大，糖化型淀粉酶的活力最高，可达（3 100.16±109.43） U/g，该菌的糖化酶活力很高[12]，对大曲的酶活力贡献较大，是值得进一步研究的对象。

酸性蛋白酶活力为（225.69±2.69） U/g，在酿酒的酸性环境中多种霉菌能产酸性蛋白酶，有利于酿酒蛋白类物质的降解[18]。课题组前期对从酱香大曲中分离到的19 株霉菌进行了的蛋白酶活力测定，最高的为113.78 U/g[3]。进一步对从酱香大曲中分离到的35 株霉菌进行了的酶活力研究，其结果表明霉菌的蛋白酶活力可达到694.52 U/g[12]。因此阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）的蛋白酶活力表现出相对较高水平。测定各种酱香大曲霉菌的脂肪酶活力最高在101.52 U/g、纤维素酶在5.55 U/g[3]，阿姆斯特丹散囊菌的脂肪酶和纤维素酶活力分别为（13.56±1.73） U/g和（4.14±0.16） U/g，表明该菌对脂肪和纤维素有一定的分解能力。果胶酶能够降低原料的黏度[19]，也可以降低葡萄酒中挥发酸的生成量，促进多酚和多种香气的生成[20]。产果胶酶的微生物主要有杆菌和曲霉等。在对酱香大曲酶系与大曲中微生物产酶关系的研究结果表明，只有部分细菌与霉菌能够产果胶酶，其产果胶酶活力为320.87～734.73 U/g，而阿姆斯特丹散囊菌的果胶酶活力可达到（435.88±68.49） U/g，同纤维素酶协同作用，可以提高原料中淀粉的利用率，进而提高出酒率。

表2 阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）5 种酶酶活力的测定结果Table 2 Five enzyme activities ofEurotium amstelodami FBKL3.0120

2.5 阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）固态发酵物香气成分分析

表3 阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）固态发酵物挥发性成分Table 3 Volatile components produced byEurotium amstelodami FBKL3.0120 in solid-state fermentation

实验对阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）进行模拟发酵实验，通过固态微萃取与气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术，对其发酵产物的挥发性香味成分进行测定，所鉴定出的各种挥发性香气成分如表3所示。从该菌的发酵物中共检出41 种物质，其中有10 种化合物未知。检测鉴定出醛类化合物6 种，体积占全体挥发性物质的2.03%；醇类化合物4 种，体积占全体挥发性物质的23.73%；酮类化合物6 种，体积占全体挥发性物质的47.45%；呋喃类化合物3 种，体积占全体挥发性物质的7.11%；其他类化合物12种，体积占全体挥发性物质的19.68%。其中醇类化合物的L-芳樟醇的相对含量达到16.37%，该物质属于具有浓烈花香味的天然香料物质，是重要的香味添加物质；1-辛烯-3-醇的相对含量为6.95%，它存在于日本松蕈和蘑菇中，是蘑菇散发出来的重要香味物质，具有特有的蘑菇香。酮类物质中的3-辛酮相对含量最高，可达到41.23%，具有树脂香。呋喃类化合物2-正丙基呋喃与2-戊基呋喃是主要的呈果香物质。2-庚酮含有特有的坚果油香、杏仁香气；三甲基丁醛具有香蕉、苹果香味；较少的二甲基丁醛、己醛、反-2-己烯醛、芳樟醇氧化物还能提供淡雅的青草香。这与何红霞[21]、陈云兰等[22]在研究茯茶“散茶发花”过程香气成分的变化结果相似，而1-辛烯- 3-醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物是形成散茯茶的特征菌花香气的重要物质。

表4 阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）固态发酵物呈香物质Table 4 Aroma compounds produced byEurotium amstelodami FBKL3.0120 in solid-state fermentation

阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）除了能产花香/果香的化合物以外，还能产出菜香/草香/木香的化合物（表4）。挥发性醇类物质是花香、果香、菜香的主要香味载体物质，酮类化合物主要挥发出木香和植物油香，部分醛类、呋喃类以及其他化合物也是果香和草香载体物质。在挥发性化合物中没有检测到组成酱香型白酒风味的特征性成分吡嗪类等物质[23-24]。该菌不仅是一株产酶功能菌，也是一株重要的产香功能菌，对酱香型白酒的风味形成具有贡献。

3 结 论

本实验采用稀释平板涂布方法从遵义地区的6 个酱香型大曲中的5 个样品中均能筛选分离得到阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus）。分离得到的阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）的酸性蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶和糖化酶的在酶活力测定表明该菌对酱香大曲酶系有贡献。阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）具有产香能力，其中以产花香和水果香为主，同时有菜香，草香和木香，且呈香物质的相对含量都较高，对酱香型白酒的风味物质形成有贡献。

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Characterization of Eurotium cristatus Isolated from Maotai-Flavored Daqu, a Traditional Chinese Maotai-Flavored Liquor Fermentation Starter, for Its Abilities to Produce Enzymes and Aromas

WANG Xiaodan1,2, XU Jia2, ZHOU Hongxiang2, BAN Shidong2, QIU Shuyi1,2,*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. School of Liquor-making and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to explore mold species and functions in Maotai-fl avored Daqu, a fermentation starter culture of Chinese Maotai-fl avored liquor, we used the dilution and plate spread method to isolate and screen molds in Maotai-fl avored Daqu from 6 manufacturers in Zunyi region of Guizhou province. Then, we combined morphological observation and fungal rDNA-ITS sequence homology analysis to identify the isolated molds. Samples from 5 liquor producers were detected to each contain an Eurotium strain, which was classifi ed and identifi ed as Eurotium cristatus. Among fi ve isolates, the strain named as FBKL3.0120 was measured to have the highest saccharifying amylase activity (up to (3 100.16±109.43) U/g). The acid protease, pectase, lipase and cellulase activities of the strain were (225.69±2.69), (435.88±68.49), (13.56±1.73), and (4.14±0.16) U/g, respectively. Solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to analyze the volatile fl avor compounds produced in solid-state fermen tation by strain FBKL3.0120. The fermentation process produced strong floral, fruity and vegetable aromas. The volatile aroma components mainly included higher alcohols, ketones and furans with L-linalool, 1-octen-3-ol, 3-octanone, and 2-amylfuran being dominant, accounting for 16.37%, 41.23%, 6.95%, and 6.75%, respectively. Eurotium cristatus FBKL3.0120 could produce many enzymes and aromas, and it was one of the important molds in the microbial composition of Maotai-fl avor Daqu.

Maotai-fl avored Daqu; Eurotium cristatus; enzyme activities; aroma components

10.7506/spkx1002-6630-201611027

Q938.15

A

1002-6630（2016）11-0154-06

王晓丹, 徐佳, 周鸿翔, 等. 酱香型大曲中分离到的阿姆斯特丹散囊菌产酶产香特性[J]. 食品科学, 2016, 37(11): 154-159. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611027. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaodan, XU Jia, ZHOU Hongxiang, et al. Characterization of Eurotium cristatus isolated from Maotai-fl avored Daqu, a traditional Chinese Maotai-fl avored liquor fermentation starter, for its abilities to produce enzymes and aromas[J]. Food Science, 2016, 37(11): 154-159. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611027. http://www.spkx.net.cn

2016-01-19

贵州省工业攻关项目（黔科合GZ字[2014]3012）；贵州省重大专项项目（黔科合重大专项字[2013]6009号）；贵州省省校合作计划项目（黔科合LH字[2014]7672）

王晓丹（1980—），女，工程师，博士研究生，研究方向为应用生物技术。E-mail：wangxiaodan0516@126.com *通信作者：邱树毅（1963—），男，教授，博士，研究方向为酶工程、发酵工程、食品生物技术、白酒酿造。

E-mail：syqiu@gzu.edu.cn