舒肝颗粒的质量标准研究

朱敏+刘艳

【摘 要】目的：建立控制舒肝颗粒的质量标准。方法：对舒肝颗粒中白术、甘草、栀子、芍药进行薄层色谱鉴别；采用高效液相色谱法测定栀子苷的含量。结果：薄层色谱检出白术、甘草、栀子苷、芍药苷；栀子苷在0.2505～2.672μg范围内线性关系良好，r=0.9998，平均回收率为97.98%，RSD为2.26%（n=9）。结论：该方法简便、准确，能有效控制舒肝颗粒的质量。

【关键词】舒肝颗粒；栀子苷；HPLC

【中图分类号】R286.0 【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2016）15-0024-04

舒肝颗粒是由当归、白芍、柴胡、香附等10味中药组成，具有疏肝理气，散郁调经的功效。临床用于肝气不舒的两胁疼痛，胸腹胀闷，月经不调，头痛目眩，心烦意乱，口苦咽干，以及肝郁气滞所致的面部黧黑斑（黄褐斑）等。该制剂载于卫生部药品标准中药成方制剂第十七册中，标准编号为WS3-B-3343-98，处方合理，疗效确切。原标准中有两项TLC鉴别，无含量测定项，为了有效控制其内在质量，现对其质量标准进行了研究和提高。本研究对制剂中白术、甘草建立了薄层色谱鉴别，结果可靠。用高效液相色谱法测定栀子苷的含量，方法简便，分离度好，结果准确，可作为控制该制剂质量的方法[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 B3200S-T超声机（上海必能信超声）；高效液相色谱仪（美国Agilent 1100液相色谱仪系统）。

1.2 材料 硅胶G、GF254由青岛海洋化工有限公司提供；白术（批号：120925-201310）、甘草（批号：120904-201117）、栀子苷（批号：110749-201316）、芍药苷（批号：110736-201438）等对照药材/对照品均由中国食品药品检定研究院提供；舒肝颗粒（批号：150821，昆明中药厂有限公司）；缺有关药味的阴性对照样品自制。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 鉴别

2.1 白术的鉴别 取本品30g或9g（低糖型），加沸水10mL或3mL（低糖型）使溶解，放冷，加乙酸乙酯30mL，振摇混合，超声处理20min，静置，倾取上清液，残渣续加乙酸乙酯20mL，振摇混合，超声处理10min，静置，倾取上清液，合并上清液，以3%碳酸钠溶液振摇提取2次（20、15mL），合并碱水液，滴加浓盐酸调至pH2～3，以乙酸乙酯振摇提取2次（30mL、20mL），合并乙酸乙酯萃取液，以水20mL洗涤，分取乙酸乙酯液蒸至近干，残渣加甲醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5g，加水30mL煎煮，保持微沸30min，煎液滤过，残渣再加水20mL煎煮，保持微沸20min，煎液滤过，合并2次滤液，浓缩至约1mL，放冷，加乙酸乙酯15mL，振摇混合，自“超声处理20min”起，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液0.5mL。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验[2]，吸取上述两种溶液各10～20μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（7∶[KG-*3/5]3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃的烤箱中烘烤3～5min，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1。

2.2 甘草、栀子的鉴别 取本品20g或6g（低糖型），加沸水7mL或2mL（低糖型）使溶解，放冷，加水饱和的正丁醇25mL，振摇混合，超声处理20min，静置，倾取上清液，残留物再加水饱和的正丁醇15mL，振摇混合，超声处理10min，静置，倾取上清液，合并上清液，用正丁醇饱和的水洗涤2次（25mL、15mL），分取正丁醇液蒸至近干，放冷，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5g，加水煎煮2次（40mL、30mL），每次保持微沸20min，煎液合并，离心，取上清液，浓缩至约3mL，加水饱和的正丁醇15mL，振摇混合，自“超声处理20min”起，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液0.5mL。再取栀子苷对照品1mg，加甲醇1mL，制成1mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502），吸取上述三种溶液各5～10μL，分别点于同一以含1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，上行展至12cm以上，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品与对照药材色谱中，显相同颜色的主斑点；与对照品色谱，显相同颜色的斑点。见图2。

2.3 白芍、牡丹皮的鉴别 取2.2项下供试品溶液作为供试品溶液。取芍药苷对照品1mg，加甲醇1mL，制成1mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502），吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1）为展开剂，在氨蒸汽饱和条件下展开，上行展至12cm，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点清晰。供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图3。

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，4.6×250mm，5μm）。柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈-水（10∶90）；检测波长238nm；进样量：10μL。理论板数按栀子苷计算不低于1500。

3.2 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成50μg/mL的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，研细，取2g或0.7g（低糖型），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照试验 取缺栀子的阴性对照样品，照“3.3项”下方法制成阴性对照样品溶液，将栀子苷对照品溶液、供试品溶液和栀子阴性对照溶液，分别注入液相色谱仪中，进行测定。结果显示供试品与栀子苷在相应位置有对应的峰，阴性对照在相应位置无对应峰。结果见图4。

3.5 线性关系考察 精密称取栀子苷对照品16.7mg，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成668g/mL的溶液。精密取上述对照品溶液分别稀释成25.05、50.1、100.2、133.6、200.4、267.2μg/mL的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积积分值为纵坐标，以栀子苷进样量（μg）为横坐标作线性回归，绘制标准曲线，得回归方程：Y=1493.52597X+10.24901，结果表明，栀子苷在0.2505～2.672μg之间呈良好线性关系。

3.6 稳定性试验 取舒肝颗粒同一供试品溶液，在0、2、4、7、9h分别进样10μL，其峰面积值分别为706.67590、729.11920、683.20715、716.02106、703.53308，RSD=2.39%，结果表明，在9h内供试品溶液中的栀子苷稳定。

3.7 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液（176μg /mL）各5μL，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。各次测得的峰面积值分别是1543.17090、1503.70020、1536.67627、1535.26611、1533.99133、1500.86377，平均值为1525.61143，RSD为1.20%。

3.8 重复性试验 取批号为150821的舒肝颗粒，按正文所列的含量测定方法，分别制备9份供试品溶液，分别测定栀子苷含量，栀子苷平均含量为0.5507mg/g，RSD为1.27%（n=9），说明本方法重复性良好。

3.9 回收率试验 采取全程加样法。取已知含量的样品（批号：150821，栀子苷含量：0.5507mg/g）9份，精密称定，分成3组，分别精密加入高、中、低三组剂量的栀子苷对照品，按样品测定方法测定栀子苷含量，平均回收率为97.98%，RSD=2.26%。结果见表1。

3.10 耐用性试验 取同一批号的样品，照样品含量测定方法，分别变动样品测定的色谱条件，测定栀子苷含量。以考察测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。分别于不同流动相乙腈-水（9∶91）、（10∶90）、（11∶89）测定样品中栀子苷含量，RSD为2.59%；分别于不同流速（0.9、1.0、1.1mL/min）测定样品中栀子苷含量，RSD为0.05%；分别于不同柱温（20、30、40℃）测定样品中栀子苷含量，RSD为2.31%；分别于不同波长（228、238、248nm）测定样品中栀子苷含量，RSD为2.32%；分别于不同色谱柱测定样品中栀子苷含量，RSD为2.33%。其结果表明耐用性良好。

3.11 样品测定结果 20批舒肝颗粒的测定结果，样品含量见表2。

4 讨论

4.1 含量测定中，首先进行检测波长的选择：精密称取栀子苷对照品适量，加50%甲醇制成每1mL含17.568μg/mL的溶液，在紫外可见分光光度仪上进行栀子苷的紫外光谱扫描，得到栀子苷的紫外吸收光谱，可见栀子苷在238nm处有最大吸收，故选择238nm作为栀子苷的检测波长。流动相的选择：曾以甲醇-水（20∶80）；乙腈-水（9∶91）（10∶90）；乙腈-0.1%磷酸（10∶90）分别做流动相试验，试验结果表明：采用乙腈-水（10∶90）作为流动相，栀子苷与其他组分的分离度能达到要求，空白试验也无干扰，故选用。

4.2 分别对供试品制备中的提取溶剂、提取方法和提取时间、提取溶剂用量进行了考察。分别采用甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇进行提取，实验表明甲醇和50%乙醇提取的栀子苷含量相近，但因50%乙醇提取滤过液困难，故选取甲醇作为提取溶剂。考察了超声处理20min、30min、40min、60min，对栀子苷含量的影响，结果表明超声处理30min已提取完全。考察了15mL、25mL、40mL三种不同用量，结果表明提取溶剂加入25mL基本提取完全。故确定供试品的制备方法为：加甲醇25mL超声提取30min。

参考文献

[1]国家药品监督管理局.中药新药质量标准研究的技术要求[R].

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

（编辑：熊金富）