重组蛋白sCAR⁃TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

罗丹枫 龚静吉 程腾 魏睿 魏军成 祝文涛

·实验研究论著·

重组蛋白sCAR⁃TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

罗丹枫 龚静吉 程腾 魏睿 魏军成 祝文涛

目的提高腺病毒（adenovirus,ADV）在缺乏柯萨奇腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor,CAR）的骨肉瘤细胞中的转染效率。方法通过昆虫（Bac⁃to⁃Bac）杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段（sCAR）及TMTP1肽的重组蛋白（sCAR⁃TMTP1），并对其纯化、鉴定。流式细胞仪分别检测骨肉瘤细胞及人胚肾细胞293（HEK293）的CAR表达水平，ADV对其的感染效率及FITC⁃TMTP1的结合能力。重组蛋白sCAR⁃TMTP1与ADV共同孵育形成复合物，流式细胞仪研究其在缺乏CAR的骨肉瘤细胞（MG⁃63）中的转染效率。结果表达及纯化的sCAR⁃TMTP1蛋白在相对分子质量约31 000处可见特异蛋白条带，感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠sCAR单克隆抗体发生特异性反应。MG⁃63可与FITC⁃TMTP1特异结合，其CAR表达水平低，ADV转染效率低。经sCAR⁃TMTP1修饰后的ADV/GFP对MG⁃63细胞的感染效率显著高于未经修饰的含报告基因GFP的ADV（ADV/GFP）。结论重组蛋白sCAR⁃TM⁃TP1可显著提升ADV对缺乏CAR的骨肉瘤细胞的转染效率。

骨肉瘤；腺病毒；TMTP1肽；柯萨奇腺病毒受体；重组蛋白；基因治疗；肿瘤细胞

骨肉瘤（osteosarcoma）是最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年，其极易出现复发和转移，且血行转移发生早，其中最常见的是肺转移。对于发生转移的患者，常规进行手术治疗及化疗，但临床疗效不佳，愈后不良，亟需探索发现新的治疗模式［1］。

基因治疗是一种有前景的新型治疗策略，腺病毒（adenovirus,ADV）因具有转染效率高、不整合到靶细胞基因组中、遗传毒性低等优点，已成为基因治疗中最常见的病毒载体之一［2］。ADV对细胞的感染依赖于细胞表面表达的柯萨奇腺病毒受体（coxsack⁃ie and adenovirus receptor,CAR），但在肿瘤细胞表面，CAR的表达显著下调［3］，使得重组ADV载体难以转染肿瘤细胞，影响了治疗效果。因此，提高重组ADV载体对靶细胞的感染效率对于改善肿瘤基因治疗的疗效具有十分重要的意义。

对ADV载体纤维蛋白进行修饰是提高其对宿主细胞感染效率的主要途径之一。TMTP1肽是一类可以特异性识别肿瘤及其微小转移的靶向多肽，可以偶联核素、可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands,sTRAIL）等基团实现对多种肿瘤的靶向诊疗，具有良好的应用前景［4⁃6］。本研究通过昆虫（Bac⁃to⁃Bac）杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段（sCAR）及TMTP1肽的重组蛋白（sCAR⁃TMTP1），用于与ADV的纤维蛋白的头节（knob）形成嵌合体，并考察经此修饰的ADV对CAR低表达的骨肉瘤细胞的转染效率。

材料与方法

一、实验材料

（一）质粒、菌种、病毒与细胞系

含有CAR全长的真核表达质粒pTOPOCAR由Jer⁃Tsong Hsieh教授（the University of Texas South⁃western Medical Center）惠赠。大肠杆菌DH10⁃BacTM、pFASTBACHTb载均购自Invitrogen公司，大肠杆菌株DH5α由华中科技大学同济医学院同济医院肿瘤生物医学中心（本中心）引进并保存。含报告基因GFP的ADV（ADV/GFP）由本中心构建［7］，病毒在人胚肾细胞293（HEK293；ATCC）中扩增后，经氯化铯超速离心纯化、滴度测定后保存于-80℃冰箱。昆虫细胞sf⁃9，人成骨肉瘤细胞系MG⁃63、Saos⁃2、U2OS均购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

（二）主要试剂

MiniBESTViral RNA/DNA Extraction KitVer 3.0试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ、SolutionⅠDNA连接酶、ExTaq酶均购自大连宝生物工程有限公司。培养基MEM、DMEM、SF900Ⅱ和Grace、杆粒提取试剂盒PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit、转染试剂Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司。FITC标记的多肽TMTP1（GCGNVVRQCG）是本中心前期研究所获得的一段可以特异结合高转移潜能肿瘤细胞的短肽，由西安华辰公司合成。

（三）引物设计

嵌合体sCAR⁃TMTP1、嵌合体sCAR的基因引物均由上海英骏公司合成，两者的NCBI号均为NC_000021.9（表1）。

二、实验方法

（一）重组蛋白sCAR⁃TMTP1及sCAR的构建

利用基因岛分析软件分析获得多肽TMTP1偏向于真核表达系统表达的核苷酸序列5′⁃GGCTGC GGTAACGTGGTAAGGCAAGGCTGC⁃3′，在其5′端加入与从GenBank获得sCAR CDS末尾15个核苷酸，3′端加入XhoⅠ酶切位点及保护碱基，以此构成嵌合体sCAR⁃TMTP1的下游长链引物。嵌合体sCAR⁃TMTP1上游引物序列由BamHⅠ及与sCAR CDS 1⁃16 bp互补的碱基序列构成，PCR扩增sCAR，回收测序无误后，插入pFASTBACHTb中构成重组穿梭质粒，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，双酶切及PCR鉴定阳性克隆，并送生工生物工程（上海）有限公司测序。测序正确的质粒命名为pFastBac™HTB sCAR⁃TMTP1。参考Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统技术手册，取重组穿梭质粒转化感受态大肠杆菌DH10BacTM，筛选鉴定后获得重组杆粒Bacmid⁃sCAR⁃TMTP1。同法构建杆粒Bacmid⁃sCAR。

（二）重组杆粒的表达、纯化及分析

表1　基因引物序列

参看Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统技术手册及文献。收获P3、P4、P5代重组杆状病毒后，将0.05MOIP3和P4代重组杆状病毒分别感染200m l悬浮培养的sf9细胞（2×106个/m l），27℃水浴摇床培养5 d，2 292 r/min，离心20min，收集沉淀、重悬，超声破碎后，3 300 r/min，离心30min，收集上清液。应用阳离子交换层析系统纯化蛋白，收集感染P3和P4代重组杆状病毒的细胞裂解及培养上清液，反复冻融3次，裂解细胞，然后低温离心，收集细胞裂解液上清。将细胞裂解液上清液和病毒培养上清液分别加入蛋白的上样缓冲液，沸水浴5min，取样进行12％SDS⁃PAGE分析。取纯化后的蛋白，经12％ SDS⁃PAGE分析后，半干法转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h后，加入sCAR单克隆抗体Western Blot检测。

（三）ADV/GFP感染效率测定

细胞按照2×105个/孔接种于6孔板，各株细胞分别设立对照组（不加入ADV/GFP）和实验组（加入0.1MOIADV/GFP）。第2天加入0.1MOI 2％FBS/ DMEM培养基稀释的ADV/GFP 0.5 m l/孔。室温孵育30 min，吸净培养基，用2％FBS/DMEM洗孔板1次，加入2％FBS/DMEM 2m l/孔，37℃培养1 h后更换为完全培养基。细胞培养箱中培养48 h后流式细胞仪检测细胞GFP表达的百分率。

（四）FITC⁃TMTP1的细胞结合及拮抗实验

取对数生长期的HEK293及骨肉瘤细胞以4× 105个/孔种于12孔板内，37℃培养过夜待贴壁完全后，胰酶消化细胞并PBS漂洗，以500μlDMEM重悬的细胞作为空白对照，FITC⁃TMTP1组分别加入1、5、10μmol/L FITC⁃TMTP1培养基500μl重悬的细胞。利用未标记的游离TMTP1进行拮抗实验，细胞准备：37℃培养箱孵育30min后，PBS漂洗2次，流式细胞仪检测FITC标记阳性率。为验证TMTP1与细胞结合的特异性，FITC⁃TMTP1组预先用50μmol/L TMTP1于37℃培养箱孵育30 min后，PBS漂洗2次，再加入10μmol/L FITC⁃TMTP1上述孵育、漂洗步骤，然后流式细胞仪检测FITC标记阳性率。各组实验重复3次后统计分析平均阳性率及标准误。

（五）sCAR⁃TMTP1修饰前后的肿瘤细胞转染效率

P4代细胞裂解及培养上清经吸附柱3轮洗脱纯化后的得到总量约300 ng重组蛋白sCAR⁃TMTP1，溶于10μl超纯水-20℃保存。为探索最适浓度，取CAR低表达的MG⁃63细胞，按1×104个/孔的密度接种于96孔板中预实验，取30 ng的sCAR⁃TMTP1倍比稀释与0.1 MOI 2％FBS/DMEM培养基稀释的ADV/GFP 100μl混合，室温孵育10min，加入吸净原培养基96孔板中，继续室温孵育30min，吸净培养基，用2％FBS/DMEM 2ml/孔洗孔板1次，37℃培养1 h后更换为完全培养基。细胞培养箱中培养48 h后，荧光显微镜下观察各组荧光强度，筛选得出最适浓度为30μg/L。正式实验2×105个/孔接种于6孔板，分别设立对照组（单加入0.1MOIADV/ GFP）、sCAR⁃TMTP1组（加入0.1 MOIADV/GFP+ sCAR⁃TMTP1）、sCAR组（加入0.1 MOIADV/GFP+ sCAR）。第2天加入0.1MOI 2％FBS/DMEM培养基稀释的ADV/GFP 0.5m l/孔，重复上述过程，细胞培养箱中培养48 h后流式细胞仪检测细胞GFP表达的百分率。

三、统计学处理

结果

一、重组蛋白sCAR⁃TMTP1和sCAR的纯化及鉴定

P3代重组杆状病毒滴度为1.7×107pfu/m l（pfu= CCID 50×0.69）。P3、P4代重组杆状病毒感染后的细胞裂解上清及培养上清经吸附柱数轮的吸附、洗脱后经12％SDS⁃PAGE分析，均可见相对分子质量约31 000特异蛋白条带（图1）。纯化的重组蛋白经SDS⁃PAGE及Western Blot分析，也在在相对分子质量约31 000处，均可见特异的蛋白条带，并可与兔抗小鼠sCAR单克隆抗体发生特异性反应。嵌合体sCAR⁃TMTP1与嵌合体sCAR仅相差10个氨基酸的大小，两者在条带大小上比较并无明显差别（图2）。

图1　纯化后sCAR⁃TMTP1的SDS⁃PAGE分析M：蛋白Marker分子量；1～6分别代表第1～6轮洗脱样品

二、骨肉瘤细胞株中CAR表达水平与ADV感染效率关系

流式细胞仪检测不同骨肉瘤细胞株中CAR表达水平，以HEK293细胞作为阳性对照，MG⁃63的CAR表达水平最低（表2）。同时ADV/GFP以0.1 MOI分别感染上述细胞，流式细胞仪检测GFP蛋白表达阳性细胞比率，HEK293为61.13％±1.22％，MG⁃63为2.92％±0.85％，Saos⁃2为13.20％±1.40％，U2OS为13.20％±1.40％。结果显示ADV/GFP对不同骨肉瘤细胞株中的感染效率与其CAR表达水平具有正相关性。

图2　表达产物的鉴定P4：第4代裂解上清；P3：第3代裂解上清；sCAR：加入第4代重组杆状病毒（Bacmid⁃sCAR）的细胞裂解及培养上清；M：蛋白marker分子量

表2　不同细胞中CAR表达水平及ADV/GFP感染效率测定（±s，％）

表2　不同细胞中CAR表达水平及ADV/GFP感染效率测定（±s，％）

细胞系HEK293 MG⁃63 Saos⁃2 U2OS CAR表达的阳性率91.30±1.63 0.65±0.07 26.26±0.48 32.46±1.65细胞表达GFP蛋白的阳性率对照组0.50±0.04 0.46±0.05 0.47±0.04 0.49±0.03实验组61.13±1.22 2.92±0.85 13.20±1.40 18.07±0.40

三、TMTP1肽靶向结合部分骨肉瘤细胞

部分骨肉瘤细胞能够与FITC⁃TMTP1结合，而且随着FITC⁃TMTP1浓度的提升，多肽与细胞间的结合能力显著增强，与阴性对照HEK293细胞相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。按实验方法中FITC⁃TMTP1的细胞结合及拮抗实验所述，当使用50μmol/L TMTP1与10μmol/L FITC⁃TMTP1（5∶1）共同孵育细胞时，FITC⁃TMTP1与骨肉瘤细胞株之间的结合被显著抑制（图3），提示TMTP1与骨肉瘤细胞的结合是特异性的。

四、重组蛋白sCAR⁃TMTP1增强ADV/GFP对MG⁃63细胞的转染效率

在摸索最适蛋白浓度时，我们发现在30μg/L sCAR⁃TMTP1蛋白与0.1MOIADV/GFP混合后，转染MG⁃63细胞，实验组荧光强度较对照组（0.1MOI ADV/GFP）提升8～10倍（图4）。以此浓度进行正式实验中，结果显示sCAR⁃TMTP1组的荧光阳性率为28.5％±1.33％，相较对照组的6.3％±1.72％、sCAR组的7.4％±1.5％，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而sCAR组仅加入含有sCAR的蛋白，与对照组比较并差异无统计学意义（P＞0.05）。在对HEK293细胞重复上述实验时，sCAR⁃TMTP1组和sCAR组因重组sCAR蛋白事先与ADV上的knob结合，导致ADV对HEK293细胞的转染效率明显下降（90％vs.47％，90％vs.55％）。提示ADV/GFP对MG⁃63细胞转染效率的提升确实为重组蛋白sCAR⁃TMTP1所介导。

图3　HEK293及骨肉瘤细胞株与FITC⁃TMTP1的结合能力的测定1、5和10μmol/L为1、5和10μmol/L FITC⁃TMTP1；Antag：10 μmol/L FITC⁃TMTP1+50μmol/L TMTP1。与1μmol/L比较，*P＜0.05；与10μmol/L比较，#P＜0.05

图4　重组蛋白sCAR⁃TMTP1增强ADV/GFP对MG⁃63细胞的转染效率与对照组比较，*P＜0.05，#P＞0.05

讨论

ADV是一种无外壳的双链DNA病毒，它的诸多生物学特性：①能有效进行增殖，有高滴度的重组病毒产量（通常＞1 010 pfu/ml），浓缩后仍可增加100倍；②除一些抗ADV感染的淋巴瘤细胞外，可在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；③病毒基因组不整合到宿主细胞（除卵细胞）基因组中，减少了重组突变危险；④病毒基因组大，可插入大片段外源基因（至多可达35 kb）等，使其成为肿瘤的基因治疗中的重要工具，目前已有多种溶瘤ADV被应用于肿瘤治疗的临床前或临床研究中，对其安全相关性及效用进行了广泛、深入地验证及评估［8⁃10］。

目前常用的以2型和5型ADV构建而成的溶瘤ADV感染细胞均需首先通过其纤毛的knob与细胞表面的CAR黏附、结合，然后病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD再与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，再通过“内化作用”进入细胞从而完成基因转录及病毒DNA复制。而且研究表明sCAR已经足以介导病毒与细胞结合及感染［11，12］。但CAR在许多原发性肿瘤细胞中的表达往往下调和缺失，并随肿瘤分级和分期的升高而逐渐降低，而在一些正常组织（如：肝）却可高表达CAR，使得ADV载体介导的基因治疗效果受到明显影响［13，14］。因而亟需采取相应措施在病毒感染细胞阶段进行靶向调控，降低其对正常组织的亲和感染，提高其对肿瘤细胞的特异性感染，从而提高病毒的肿瘤靶向性和溶瘤效应。

为了解决此问题，常用的策略是通过基因工程技术对ADV的结构蛋白基因进行修饰，用新的短肽、抗体等特异性配体将整个病毒纤毛的knob加以替换或者将其插入knob的HI环上［15⁃17］。但此方法有着改造过程复杂，难以大量、经济地获得所需要的病毒，且存在插入病毒基因组外源基因大小受限以及改造过程可能对病毒的正确组装的带来干扰等局限性。而具有双特异性的适配子（bispecific adap⁃tor）成为了一种新的可供选择的针对病毒外壳的修饰方式。适配子一端表达CAR的蛋白，另一端通过化学偶联抗体或者表达特异的配体蛋白，适配子一方面通过CAR与ADV纤毛的knob牢固结合，封闭ADV的固有嗜性，另一方面通过偶联的特异性的配体分子引导ADV实现特异的靶向结合。这样既可以克服前述策略的局限性，又能简单、高效地实现ADV的特异性靶向［18，19］。本研究旨在通过构建含有一种新型肿瘤靶向多肽TMTP1和sCAR的适配子来实现提升ADV对CAR低表达肿瘤的细胞的基因转导效能。我们将短肽TMTP1的核酸序列设计并入扩增sCAR的下游引物中，通过优化长链PCR反应条件，将测序正确的sCAR⁃TMTP1克隆入杆状病毒表达系统的穿梭质粒，然后提取含有sCAR⁃TMTP1基因的重组Bacmid，将其转染入昆虫细胞最终获得重组表达目的蛋白sCAR⁃TMTP1。由于同一氨基酸可能由不同的密码子翻译出，在短肽氨基酸序列反推核苷酸序列的过程中，我们利用生物信息学技术分析、选择适合于杆状病毒表达系统中核苷酸序列，以提高杆状病毒表达系统正确表达目的短肽。而杆状病毒表达系统的使用，虽然在重组蛋白的得率上不及大肠杆菌等原核表达系统，但也避免了潜在的重组蛋白的复性以及部分或者全部的溶解性不佳等常见的问题。

TMTP1是我们前期研究所获得的一段可以特异结合高转移潜能肿瘤细胞的短肽，其核心序列为NVVRQ。系列研究证实TMTP1对胃癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤有特异的靶向识别能力，而且对小于2mm的亚临床病灶有着良好的识别能力，具备较好的向临床转化的前景［20，21］。本研究中发现TMTP1也可以特异地结合骨肉瘤细胞株MG⁃63、Saos⁃2、U2OS，与文献中提及的上述细胞具有较高的恶性转化和转移潜能相符［22，23］。同时因为MG⁃63细胞CAR表达水平较低，可用来验证重组蛋白sCAR⁃TMTP1修饰后的ADV/GFP的感染效率，结果表明修饰后的ADV对MG⁃63细胞的感染效率显著高于未经修饰的病毒。但我们也注意到，与利用RGD、NGR短肽改造病毒外壳的实验相比较，本实验4～5倍的基因转染效率要低于文献所述提升17倍的程度［24］，考虑可能与检测转导效率手段的差异以及TMTP1介导了不同的ADV内吞机制有关。目前我们正尝试分离鉴定TMTP1在细胞膜表面的受体，研究其可能介导的入胞作用的分子机制。同时研究携带自杀基因的新型ADV，以增强病毒对骨肉瘤细胞的杀伤效应，此也是我们另一个正在开展的研究方向。

目前已有ADV用于肉瘤治疗的Ⅰ期临床报道，其效能与安全性已得到验证［25］。病毒介导的基因治疗有望与手术、化疗一样成为骨肉瘤常规诊疗的一部分。尽管面临着众多挑战，研究新型的溶瘤ADV，提升病毒治疗的特异性和效能，仍将是今后的主要研究方向，而本研究希望能为此提供有益的参考。

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The recombinant fusion protein sCAR⁃TMTP1 enhances thegene transfer efficiency of ADV on human osteosarcoma cells.

LUO Danfeng*,GONG Jingji,CHENG Teng,WEIRui,WEI Juncheng,ZHU Wentao.*Department ofGynecology and Obstetrics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Scienceand Technology,Wuhan 430030,China
Corresponding author:ZHUWentao,E⁃mail:wentao⁃zhu@hotmail.com

Objective To enhance the transduction efficiency of adenovirus on coxsackievirus and adenovirus receptor(CAR)deficient human osteosarcoma cells.M ethods The recombinant protein sCAR⁃TMTP1wasexpressed and purified by Bac⁃to⁃Bac system,then identified by SDS⁃PAGE andWestern blotting. The expression levelof CAR and the infection efficiency of ADV/GFP in different cell lines(osteosarcoma cells ＆amp;293)were detected by flow cytometry(FCM),and the positive rate of FITC⁃TMTP1 binding to above cell lineswas also measured by FCM.MG⁃63 cells were exposed to Ad/sCAR⁃ligand complexesmixtures,and the infection efficiency of ADV/GFPwasmeasured by FCM.Results Either ofexpressed and purified sCAR⁃TMTP1 showed a specific protein band with a relativemolecularmass of 31 000,withwhich the supernatantof lysed sf9 cells infected showed specific reaction with rabbit anti⁃mouse sCAR monoclonal antibody.FITC⁃TMTP1 specifically bound to the MG⁃63 cellswith a lower level of CAR and poor infection efficiency of ADV. ADV/GFP modified with sCAR⁃TMTP1 mediated an obvious enhancements of GFP expression in MG⁃63, compared with those cells exposed to ADV/GFP.Conclusion The recombinant fusion protein sCAR⁃TMTP1 has theability toenhance thegene transferefficiency ofADV on CAR deficienthuman osteosarcoma cells.

Osteosarcoma;Adenovirus;TMTP1;Coxsackie and adenovirus receptor;Recombinant protein;Gene therapy;Tumer cell

10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.06.013

国家自然科学基金资助项目（81202061）

430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科（罗丹枫、龚静吉、程腾、魏睿、魏军成）；骨科（祝文涛）

祝文涛，E⁃mail：wentao⁃zhu@hotmail.com

（2016⁃06⁃25）