马氏珠母贝细胞周期分裂基因CDC45基因特征、表达量与性状相关分析

彭慧湃，赵红艳，雷 超，王庆恒,，焦 钰,，李俊辉

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.湖北医药学院基础学院，湖北 十堰 442000；3.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524088）

马氏珠母贝细胞周期分裂基因CDC45基因特征、表达量与性状相关分析

彭慧湃1，赵红艳2，雷 超1，王庆恒1,3，焦 钰1,3，李俊辉1

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.湖北医药学院基础学院，湖北 十堰 442000；3.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524088）

采用RACE技术克隆了马氏珠母贝细胞周期分裂基因45（Pm-CDC45）全长序列，利用荧光定量PCR检测该基因在闭壳肌、鳃、性腺与外套膜组织的表达量，并估计基因表达量与金黄壳色第3代选育群体壳高性状的相关性。结果表明：Pm-CDC45基因序列全长为2 091 bp，5′非编码区（5′UTR）为157 bp，3′非编码区（3′UTR）为34 bp，其中开放阅读框为1 967 bp，编码655个氨基酸；Pm-CDC45在各组织的相对表达量存在显著差异（P ＜0.05），其中闭壳肌表达量最高，鳃和性腺为其次，外套膜最低；Pm-CDC45基因相对表达量与选育群体壳高性状与存在显著的正相关（r=0.531，P＜0.05）；马氏珠母贝Pm-CDC45为影响壳高性状基因。

马氏珠母贝；CDC45基因；基因表达量；壳高性状；相关分析

细胞周期分裂基因45（cell division cycle gene 45，CDC45）是调控DNA复制起始的一个基因。CDC45在真核生物DNA复制和延伸中发挥重要功能，在DNA复制时CDC45对于激活起始DNA的复制具有至关重要的作用，CDC45可作为连接复制前复合体，CDC45参与细胞的表达调控，如肿瘤细胞中CDC6、CDC45的表达比正常细胞高[1]。在植物中CDC45基因参与减数分裂染色体的形成与分离及减数分裂细胞周期进程中所需的蛋白水解反应等过程[2]。CDC45基因在细胞周期的S期中都有明显的变化[3-4]。

马氏珠母贝Pinctada fuctada martensii是我国生产海水有核珍珠的主要贝类。近年来，由于养殖群体性状退化及海区环境的污染，我国的海水珍珠产量与质量均明显下滑，2015年我国海水珍珠产量不到4 t[5]。通过遗传育种培育适合海区养殖的新品种是解决目前产业困境的关键途径之一，目前利用家系选择与群体选择技术培育了马氏珠母贝“海优1号”与“海选1号”等养殖新品种，这些品种均表现出优良育珠性能，在相同养殖条件下与对照群体比较，2龄“海选1号”的壳宽和壳长分别提高 21.2%和 20.8%，育珠期间母贝的留核率、珠层厚度和珍珠产量分别提高22.3%、22.2%和24.7%[6]。

马氏珠母贝1.5～2.0龄达到性腺成熟，按照常规育种技术需要8～10 a才能培育一个养殖新品种。借鉴家禽育种实践，可以通过筛选与性状紧密连锁的分子标记辅助育种，能有效缩短育种周期。目前已有马氏珠母贝分子辅助育种研究报道[7-8]，利用关联分析筛选生长性状紧密连锁的分子标记，获得马氏珠母贝影响生长性状相关基因。基于前期基础，笔者拟研究马氏珠母贝Pm-CDC45基因序列特征，估计基因表达量与生长性状的相关性，以期为马氏珠母贝分子标记辅助育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验材料为马氏珠母贝金黄壳色第3代选育群体，贝龄2龄，壳长4.0～6.0cm，选育群体的构建方法见文献[9]。

1.2 基因全长克隆

1.2.1 RNA提取和第一链 cDNA的合成 采用Trizol法提取总RNA，RNA沉淀用10～25 µL DEPC处理的超纯水溶解。NanoDropND1000紫外分光光度计测A260/A280值分析浓度及纯度。中间片段 cDNA 模板的合成依据 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）说明书进行，模板 制 备 参 照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）说明书。

1.2.2 引物设计 利用 Primer Premier 5.0设计Pm-CDC45引物。先设计合成中间片段引物，再利用所得中间片段分别设计 5′RACE和 3′RACE巢式引物，用于Pm-CDC45基因的全长克隆；同时设计荧光定量引物（表1）。

表1 Pm-CDC45基因克隆及荧光定量的引物序列Table 1 Primer sequence used in the cloning and real-time PCR of Pm-CDC45 gene

1.2.3 Pm-CDC45 基因克隆 利用引物ZJ-F/ZJ-R进行中间片段扩增，10 µL PCR 反应体系：Premix Taq 5 µL，模板cDNA（20ng/模板）0.4 µL，ZJ-F引物 0.4 µL，ZJ-R引物0.4 µL，ddH2O 3.8 µL。PCR反应程序为：94℃预变性 5min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2min，35个循环；72℃保温 10min；4℃保存。PCR产物经检测证实为目的产物大小后，通过 1mg/mL琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，并将纯化产物连接至 pMD18-T载体后转化至感受态细胞，于 LB液体培养基培养该感受态细胞，菌液涂布于LA（含氨苄青霉素Amp+）固体平板并倒置37℃培养，挑取阳性克隆测序即可获得目的片段序列。

1.2.4 RACE扩增 利用3′RACE的巢式引物依次进行3′末端序列的扩增，PCR扩增体系共10 µL体系：模板cDNA（20ng/扩增）0.4 µL，Taq 5 µL，3′-1/3'-2引物 0.4 µL，Upm 0.4 µL，灭菌ddH2O 3.8 µL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性 30 s，65.4℃退火30 s，72℃延伸2min，35循环；72℃保温10min；4℃保存。5′端扩增利用巢式引物5′-1与5′-2进行5′末端的巢式扩增。

1.2.5 序列分析 根据上述测序结果，将所得序列序拼接，得到基因的cDNA全序列。利用NCBⅠ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线工具，将所得序列应用 BLAST程序进行序列同源性比对和相似性分析；利用NCBⅠ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）查找开放阅读框（ORF）的以及氨基酸序列的翻译；运用 SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）在线分析软件进行信号肽预测；使用NetPhos软件对氨基酸序列的物理化学性质进行分析；http://www.predictprotein.org/在线预测蛋白质结构。

1.3 基因在组织表达量差异分析

从金黄壳色第3代选育群体取样10个个体，解剖剪取闭壳肌、外套膜、鳃与性腺组织，放入冻存管，立即放入液氮中保存。利用 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）进行反转录获得所需的cDNA模板，然后进行荧光定量PCR检测。以β-actin作为荧光定量PCR内参。

1.4 基因相对表达量与性状相关分析

从金黄壳色第3代选育群体取样个体20个，测量壳高性状，剪取闭壳肌放入冻存管，并立即放入液氮中保存。利用 Reverse Transcriptase M-MLⅤ（RNaseH）进行反转录获得所需的cDNA模板，然后进行实时荧光定量PCR检测。

1.5 数据分析

利用单因素方差分析比较各组织基因相对表达量的差异，计算基因相对表达量与壳高性状的相关性，利用 SPSS15.0软件进行所有的数据分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 Pm-CDC45基因全长与序列特征

利用 RACE技术获得了 Pm-CDC45基因cDNA全序列。该片段全长为2 091 bp，5′非编码区（5′UTR）为157 bp，3′非编码区（3′UTR）为34 bp，其中开放阅读框为1 967 bp，编码655个氨基酸，末端有26个腺嘌呤的ploy A尾巴。

利用 TMHMMServerv.2.0分析发现该氨基酸发现不存在跨膜区。利用NetPhos 2.0预测发现共有磷酸化位点36个，包括丝氨酸磷酸化位点17个、苏氨酸磷酸化位点8个和酪氨酸磷酸化位点11个。SoftBerry-Psite程序预测，发现该氨基酸序列含有N-糖基化位点1个，蛋白激酶C磷酸化位点9个，酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点8个，酪氨酸激酶磷酸化位点2个，N-豆蔻酰化位点3个，酰胺化位点1个，6个CAAX box，11个微体C-末端定位信号序列，1个细胞吸附序列（图1）。

BLAST分析发现Pm-CDC45基因与其他已知物种的 CDC45基因具有较高的同源性，其Pm-CDC45氨基酸序列与已公布的其他物种的CDC45氨基酸序列的同源性最高达 81%，多序列相似性比较表明 Pm-CDC45是高度保守的（图2）。

根据不同物种的CDC45氨基酸序列构建的系统进化树显示，脊椎动物与无脊椎动物分为两个不同的分支。 其中，马氏珠母贝的CDC45与长牡蛎等软体动物的CDC45亲缘关系较近，聚为同一支（图3）。

2.2 Pm-CDC45组织表达量分析

不同组织 Pm-CDC45相对表达量存在显著差异（P＜0.05）（图4）；闭壳肌（Mu）与鳃（Gi）基因表达量显著大于性腺（Go）与外套膜（Ma）（P＜0.05）；闭壳肌（Mu）Pm-CDC45相对表达量最高，其次是鳃（Gi）和性腺（Go），外套膜（Ma）中的表达量最低。

图1 Pm-CDC45基因cDNA序列及其编码氨基酸序列Fig.1 The full length cDNA and amino acid sequence of Pm-CDC45

图2 Pm-CDC45氨基酸序列多序列比对Fig.2 Multi-alignment of Pm-CDC45

续图2Fig.2（Continued）

图3 Pm-CDC45蛋白质聚类分析Fig.3 Cluster analysis of Pm-CDC45 protein

图4 马氏珠母贝不同组织Pm-CDC45基因表达量差异Fig.4 Relative expression of Pm-CDC45 in the different tissues of Pinctada fuctada martensii

2.3 基因表达量与壳高相关性分析

利用SPSS软件统计了闭壳肌Pm-CDC45表达量与壳高性状的相关性，结果表明Pm-CDC45表达量与壳高性状存在显著正相关（r=0.531，P=0.016＜0.05）（图5）。

图5 马氏珠母贝Pm-CDC45基因表达量与壳高性状关系Fig.5 Scatter diagram showing the relationship between shell height and relative expression of Pm-CDC45

3 讨 论

高通量测序技术已应用珍珠贝的生长、矿化与免疫基因的筛选与功能验证。Zhao等[10]利用RNA-seq技术进行马氏珠母贝珍珠囊转录组分析，通过对与Nr和Swissport数据库进行比对得到结果进行筛选，筛选出了450条与无脊椎动物免疫机制相关的同源序列，103条生物矿化相关的同源序列。为了探究Pm-CDC45在马氏珠母贝体内的功能，本研究利用荧光定量分析检测该基因在各组织的表达量，在闭壳肌基因表达量最高，性腺与外套膜的基因表达量相对较少，这说明了Pm-CDC45基因在各组织中具有不同功能。陈伟耀[11]研究了4个生长基因（TβR I、EGFR、GHITM和FGF18）在马氏珠母贝体内各组织的表达情况，结果表明不同基因在各组织存在明显差异，TβR I在鳃，足和肝胰腺中表达量最高，EGFR在足和鳃中表达量最高，GHITM在性腺中表达量最高，FGF18在性腺中表达量最高，这4个基因在血细胞表达量均最低。

与连锁图谱比较，关联分析具有不需构建作图群体、作图定位更精确与同时考察一个基因座的多个等位基因等优势[12]，该技术已应用于玉米[13]、水稻[14-15]经济作物与鸭[16]和猪[17]等畜禽动物数量性状基因定位研究。近年来，还报道了贝类性状与标记关联分析的研究[8,18-19]，邓岳文等[19]利用马氏珠母贝第4代选育群体的生长性状与50对SSR标记关联分析，获得了与体质量、壳长、壳高与壳宽显著相关的SSR标记，将筛选标记所对应的Unigene（来自转录组数据）在NCBⅠ数据库中进行Blastx搜索进行功能注释与验证；赵红艳等[8]利用马氏珠母贝杂交家系的生长性状和30个SSR标记的关联分析，获得了有7个SSR位点与生长性状显著，并利用筛选的SSR序列在NCBⅠ数据库中进行Blastx搜索，发现与壳高性状显著关联的SSR位点序列与海胆细胞分裂控制家族蛋白质 45编码序列匹配度较高。基于后者的研究结果，本研究利用RACE技术分析了马氏珠母贝Pm-CDC45的基因结构，表明Pm-CDC45基因表达量与壳高性状存在显著正相关，进一步证实Pm-CDC45基因是影响马氏珠母贝壳高性状的基因。

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（责任编辑：陈庄）

Molecular Characterization of Cell Division Cycle Gene 45 andⅠts Relationship BetweenⅠts Relative Expression and Growth Traits in Pinctada fuctada martensii

PENG Hui-pai1,ZHAO Hong-yan2,LEⅠ Chao1,WANG Qing-heng1,3,JⅠAO Yu1,3,LⅠ Jun-hui1
(1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088,China；2.Hubei University of Medicine，School of Basic Medical Sciences,Shiyan 442000,China；3.Pearl Breeding and Processing Engineering Technology Research Center of Guangdong Province，Zhanjiang 524088,China)

The full length of Pm-CDC45 was obtained by using rapid amplification of cDNA ends technology.Gene expression was detected in adductor muscle，gill，gonad and mantle.Correlation coefficient was estimated between gene expression and shell height of the third generation yellow colored selected line.The results showed that the total length of Pm-CDC45 gene length was 2 091 bp,including 1 967 bp of the open reading frame (ORF) which encodes 655 amino acids,a 5′UTR of 157 bp and a 3′ UTR of 34 bp.There existed significant differences in relative expression of Pm-CDC45 among the four tissues (P＜0.05).The highest gene relative expression was observed in adductor muscle,followed by gill,gonad and mantle.There existed a significantly positive relationship betweengene relative expression and shell height (r=0.531,P＜0.05).The present results suggest that Pm-CDC45 is an important gene that affects shell height in pearl oyster P.fuctada martensii.

Pinctada fuctada martensii；CDC45 gene；gene expression；shell height；relation analysis

S917.4

A

1673-9159（2016）06-0001-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.001

2016-04-15

国家自然基金（31372526）；广东省科技厅项目（2015A030302079）；广东海洋大学“海之帆—起航计划”大学生科技创新项目

彭慧湃（1995—），男，海洋生物专业2013级本科生。Email:405310372@qq.com

李俊辉（1976—），女，讲师，专业方向无脊椎动物增养殖。Email:lijunh@21cn.com