热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜血管内皮生长因子的影响

庞学丰++刘莎莎++李玉玲++刘欢++蒙宇华++姚平++冯玉青++吴燕红++唐丽萍

【摘 要】目的：观察清热解毒抗风湿方药——热痹康汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠滑膜血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法：将60只清洁级雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，甲氨蝶呤组，热痹康汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠采用弗氏不完全佐剂联合牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA大鼠模型。造模成功后开始给药，模型对照组给予生理盐水灌胃，热痹康汤低、中、高剂量组分别给予热痹康汤提取物低、中、高剂量灌胃，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤灌胃，空白对照组大鼠自由饮水和进食。观察不同剂量热痹康汤对CIA大鼠的关节肿胀指数及其滑膜VEGF的影响。结果：热痹康汤各剂量组及甲氨蝶呤组大鼠的关节肿胀指数均低于模型对照组（P < 0.01），其中中剂量热痹康汤作用与甲氨蝶呤相当（P > 0.05），高剂量热痹康汤作用优于甲氨蝶呤（P < 0.01）；热痹康汤各剂量组及甲氨蝶呤组大鼠滑膜的VEGF水平均低于模型对照组（P < 0.05），其中高剂量热痹康汤作用优于甲氨蝶呤（P < 0.05），中、低剂量热痹康汤作用与甲氨蝶呤相当（P > 0.05）。结论：热痹康汤治疗类风湿关节炎的机制是通过抑制滑膜VEGF的产生而实现的。

【关键词】 胶原诱导性关节炎；关节炎，类风湿；热痹康汤；血管内皮生长因子；大鼠

Effect of Rebikang Tang（热痹康汤）on Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Collagen-induced Arthritis

PANG Xue-feng，LIU Sha-sha，LI Yu-ling，LIU Huan，MENG Yu-hua，YAO Ping，FENG Yu-qing，WU Yan-hong，TANG Li-ping，LEI Zong-shang，SHU Jian-long，WANG Si-chao，DU Yong-yi，LIN Ju

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（热痹康汤—a prescription of clearing away heat and toxic materials and anti-rheumatism）on vascular endothelial growth factor（VEGF）in rats with collagen-induced arthritis（CIA）.Methods：Sixty clean-grade female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group，and low，medium and high-dose Rebikang Tang groups，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by the incomplete adjuvant combined with collagen typeⅡto establish CIA rat models.The model control group was given intragastric administration of physiological saline，the low，medium and high-dose Rebikang Tang groups were given corresponding dose of Rebikang Tang，the methotrexate group was given intragastric administration of methotrexate and the rats in the control group could drink water and eat food freely.The effects of different doses of Rebikang on joint swelling index and VEGF were observed.Results：The joint swelling indexes in each dose of Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model group（P < 0.01），among which the effect in the medium-dose Rebikang group was equivalent to that of the methotrexate group（P > 0.05） and the effect in the high-dose Rebikang group was superior to that of the methotrexate group（P < 0.01）.The synovial VEGF levels in each Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model control group

（P < 0.05），among which the effect of the high-dose Rebikang group is superior to the methotrexate（P < 0.05），

while the effects of the middle and low-dose Rebikang groups were equivalent to the methotrexate（P > 0.05）.Conclusion：The mechanism of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis can be achieved by inhibiting the generation of VEGF.

【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（热痹康汤）；vascular endothelial

growth factor；rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要侵犯外周关节的慢性自身免疫性疾病。不经规范治疗的晚期RA患者会出现关节畸形和功能丧失[1]，血管内皮生长因子（VEGF）在RA的发病、发展中起到重要的作用。本研究通过给予CIA大鼠灌服清热解毒抗风湿方药——热痹康汤，探讨其对CIA大鼠滑膜VEGF的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠60只，体质量（110±10）g，购于广西中医药大学实验动物中心。动物合格证号：桂医动字第11005号。饲养在空气流通、温度约22～25 ℃、湿度适中（不低于40%）的安静动物房内。

1.2 实验试剂 牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂（美国Chondrex公司）；检测VEGF所需试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 实验药物 本院新药研发中心负责制备提供本实验研究所用的热痹康汤提取物，将热痹康汤（原药）提取制成含有活性部位的浸膏（由本院新药研发中心负责制作）。造模时按比例加入乙醇和生理盐水溶解配制成质量分数为2×10-7 g·L-1的溶液供大鼠造模。甲氨蝶呤片购自上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂。

2 方 法

2.1 分组与造模 将60只清洁级Wistar雌性大鼠放置于鼠笼中进行适应性喂养，观察7 d无异常后随机分为模型对照组，甲氨蝶呤组，热痹康汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠按步骤分别进行造模（方法参照文献[2]）：实验时于无菌条件下，在冰面上将牛Ⅱ型胶原蛋白充分溶解于冰醋酸中，接着加入相同体积的弗氏不完全佐剂，随后一起注入医用三通管内，用注射器互相推吸以充分混合乳化，制成油包水状的CⅡ乳剂，完成后把它放置于4 ℃的冰箱进行保存。进行造模时，分别将CⅡ乳剂分多点注射于Wistar大鼠的背部和尾部皮内。注射后观察大鼠14 d，无异常后再次注射CⅡ乳剂（所用方法和药物剂量同前所述）进行免疫。

2.2 给药治疗 按70 kg人体质量与200 g大鼠换算系数为0.018，甲氨蝶呤组大鼠按甲氨蝶呤药液

2.7 mg·kg-1进行灌胃，每周1次；热痹康汤高剂量组大鼠给予31.25 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，中剂量组大鼠给予15 g·（100 g）-1·d-1

的热痹康汤提取物进行灌胃，低剂量组大鼠给予

7.5 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，每日分2次灌服；模型对照组大鼠给予生理盐水

2 mL·（100 g）-1灌服，每日1次。空白对照组大鼠不限制饮水，自由进食。

2.3 关节肿胀指数评分 治疗前及治疗后第1，2，4周分别做好各组大鼠关节肿胀指数的观察并详细记录。评分4分及以上即为造模成功（评分标准参考文献[3]进行拟定：其中表现为包括踝关节在内的全部关节肿胀者评为4分，选取造模成功的大鼠进行下一阶段实验）。

2.4 滑膜VEGF的检测 除空白对照组外，其余各组大鼠均按计划给药。4周后所有大鼠均采用水合氯醛腹腔注射进行麻醉，麻醉完全后于无菌条件下在膝关节处快速剥离滑膜组织，放置于-20 ℃冰箱保存备测。采用免疫组化法测定滑膜中的VEGF含量，项目检测步骤及方法严格按试剂盒说明书进行。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间疗效比较采用t检验，各组间的疗效比较采用方差分析。以

P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠治疗前后关节肿胀指数比较 与模型对照组比较，各治疗组大鼠关节肿胀指数治疗

2周后均有降低，其中热痹康汤高、中剂量组及甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异有统计学意义

（P < 0.01）。各治疗组大鼠关节肿胀指数治疗

4周后与模型对照组比较，差异有统计学意义

（P < 0.01），其中热痹康汤中剂量组作用与甲氨蝶呤组相当（P > 0.05），热痹康汤高剂量组作用优于甲氨蝶呤组（P < 0.01）。见表1。

3.2 各组大鼠治疗前后滑膜VEGF变化比较

各组大鼠滑膜VEGF水平明显高于空白对照组（P < 0.01）；各给药组大鼠治疗4周后的滑膜VEGF水平与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。热痹康汤中、低剂量组与甲氨蝶呤组疗效相当，差异无统计学意义（P > 0.05）；

热痹康汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

表2 各组大鼠治疗前后滑膜VEGF变化比较

组别 动物数（只） VEGF（%）

空白对照组 10 4.52±0.46

模型对照组 10 29.75±3.131）

甲氨蝶呤组 10 23.25±1.751）2）

热痹康汤低剂量组 10 22.62±1.821）2）

热痹康汤中剂量组 10 21.84±1.711）2）

热痹康汤高剂量组 10 17.61±1.671）2）3）

注 与空白对照组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.05；与甲氨蝶呤组比较，3）P < 0.05

4 讨 论

RA的发病和病情进展过程中，血管翳的形成会导致关节的破坏、畸形以及功能障碍，而血管翳形成的重要环节之一就是血管新生。VEGF在RA的发病、发展中起到非常重要的作用。有一项研究将RA患者与健康人群及退行性骨关节炎患者进行对比，结果发现，RA患者血清中VEGF水平明显升高，并且发现其与炎性指标、类风湿因子以及病情的严重程度呈正相关，笔者认为可以把VEGF作为判断RA病情是否活动的一个指标[4-5]。有实验研究证实，经向RA关节腔内注射VEGF抗体或其受体拮抗剂进行治疗，可以减轻RA的症状以及明显抑制滑膜血管翳的形成[6]。近年来多方面的研究结果已经表明，通过抑制VEGF的表达这一途径治疗RA的研究已逐渐成为新的热点和方向之一。

RA属中医学“痹病”范畴，多为机体虚弱，御邪能力低下，风寒湿热之邪入侵，痹阻于内，气血运行不畅，筋脉瘀阻而成。热痹康汤是课题负责人根据上述理论认识，结合多年临床经验总结出的经验方，由秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤、青风藤、黄柏、苍术组成，具有清热解毒、利湿除痹止痛功效，治疗RA效果较好，能明显改善湿热型患者的晨僵、关节疼痛、关节压痛、关节肿胀及关节功能，降低患者血液中明显升高的C-反应蛋白、类风湿因子、红细胞沉降率以及免疫球蛋白等实验室指标，毒副作用较少，患者耐受程度较好[7]。已完成的动物实验研究表明，热痹康汤能降低胶原诱导性关节炎大鼠血清中升高的白细胞介素-2、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及基质金属蛋白酶-3的水平[8-12]，提示热痹康汤能通过影响这些在RA的发病过程中起重要作用的促炎因子而达到治疗的作用。

本实验结果表明，热痹康汤可以通过抑制VEGF的产生，抑制血管翳的形成以及滑膜增殖，减轻炎症而起到治疗RA的作用，为进一步研究热痹康汤的作用机制提供了实验依据。

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5 参考文献

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收稿日期：2016-09-13；修回日期：2016-10-25