腹泻病婴幼儿艰难梭菌定植与感染情况分析

郭亚楠， 王君， 李佳垚， 王秋萍， 刘欣竹

临床研究

腹泻病婴幼儿艰难梭菌定植与感染情况分析

郭亚楠， 王君， 李佳垚， 王秋萍， 刘欣竹

目的 了解腹泻病婴幼儿艰难梭菌定植与感染情况并探讨其检测方法。方法 收集2014～2015年儿科消化门诊腹泻婴幼儿的临床资料及粪便，通过厌氧培养、毒素A和B PCR扩增法和酶联免疫法检测粪便中艰难梭菌和毒素。结果 65份标本中，厌氧培养阳性19例(29.23%)，19例经PCR扩增，A/B毒素阳性5例(7.69%)；酶联免疫法检测抗原阳性22例(33.85%)，与厌氧培养比较，差异无统计学意义(P>0.05)，毒素A/B阳性5例(7.69%)与PCR扩增法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 婴幼儿有较高的艰难梭菌定植率，其中多为非产毒株，并不致病；酶联免疫法检测艰难梭菌抗原和毒素可以用于临床筛检。

腹泻； 艰难梭菌； 婴幼儿

艰难梭菌又称难辨梭状芽孢杆菌，是一种厌氧、革兰染色阳性条件致病菌[1]。它分为产毒株和非产毒株，产毒株可产生A/B毒素，引起肠道炎症；非产毒株在宿主体内定植并不致病[2]。艰难梭菌感染是大量应用抗生素后，肠道菌群紊乱，艰难梭菌过度繁殖并释放毒素，引起的以肠道症状为主要表现的感染性疾病，是肠道菌群严重失调表现之一[3]。艰难梭菌定植是宿主体内有艰难梭菌的存在，但并不致病[4]。

婴幼儿处于肠道菌群的形成时期，缺少成人肠道中有益菌群；并且免疫系统未发育成熟，容易感染艰难梭菌。据报道婴幼儿有较高的艰难梭菌定植率，约35%的儿童携带有艰难梭菌，1%～84%的新生儿和健康婴幼儿体内有艰难梭菌定植[5]。但是发现多数艰难梭菌阳性的婴幼儿并无临床症状，是否与婴幼儿体内艰难梭菌产毒情况有关呢？为了解腹泻病婴幼儿艰难梭菌定植与感染情况，笔者采用三种检测方法对腹泻婴幼儿的艰难梭菌定植和产毒情况进行调查，同时对其检测方法进行了探讨，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月至2015年12月在中日友好医院儿科消化门诊的腹泻患儿，通过询问病史，查阅病历资料收集患儿信息，并收集符合筛选标准患儿的粪便标本-80 ℃保存。1.2 诊断标准 以大便性状为稀便或水样便，每日>3次为腹泻诊断标准。

1.3 纳入标准 (1)符合腹泻诊断标准；(2)年龄<3岁；(3)病程超过3 d；(4)腹泻前1个月内有抗生素应用史。

1.4 排除标准 (1)明确诊断为细菌性痢疾、伪膜性肠炎、克罗恩病及其他原因引起的脓血便病例；(2)腹泻合并休克、重度脱水、剧烈呕吐而不能进食和严重感染病例；(3)依从性差，难以完成治疗者。

1.5 试剂与仪器 CCFA艰难梭菌选择培养基；QIAamp粪便DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)；OneTaq®热启动2X Master Mix(美国 NEB公司)；艰难梭菌抗原/毒素联合快速检测试剂盒(美国 Techlab公司)；PCR扩增仪(美国GeneAmp公司)；低温冰冻离心机(美国 Thermo公司)；电泳装置(北京六一仪器)；超微量分光光度计(美国 Thermo公司)。

1.6 实验方法

1.6.1 艰难梭菌培养 粪便标本与无水乙醇以1∶1体积混合，震荡，室温静置1 h。将处理好的粪便标本接种于新鲜配制的由环丝氨酸、头孢西丁、果糖和蛋白质琼脂组成的CCFA艰难梭菌选择培养基上，置于厌氧袋中，35 ℃培养48 h。

1.6.2 艰难梭菌毒素A/B聚合酶链反应(PCR)检测 对于艰难梭菌培养阳性的标本，按照试剂盒操作说明提取粪便中细菌基因组的DNA，PCR检测毒素A和毒素B的基因，引物见表1。PCR扩增条件分别为毒素A：起始模板变性94 ℃ 10 min，模板变性94 ℃ 50 s，退火54 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 50 s共37个循环，终延伸72 ℃ 3 min。毒素B：起始模板变性94 ℃ 10 min，模板变性94.5 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s共32个循环，终延伸72 ℃ 3 min。最后琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

表1 PCR扩增毒素A和毒素B基因所需引物序列

1.6.3 艰难梭菌抗原和毒素联合快速检测 按照艰难梭菌抗原/毒素联合快速检测试剂盒操作说明，对所收集的标本进行艰难梭菌抗原和毒素检测。

1.7 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，诊断方法的一致性采用Kappa分析，Kappa值在0.4～0.75为中高度一致，>0.75为极好的一致性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿艰难梭菌培养 共收集腹泻婴幼儿65例，其中艰难梭菌培养阳性19例(29.23%)、阴性46例(70.77%)，两组一般资料比较见表2。

表2 腹泻婴幼儿艰难梭菌培养患儿的一般临床资料[n(%)]

注：与艰难梭菌培养阴性组比较，aχ2=37.10，29.25,16.86，P<0.05。

表2结果表明，艰难梭菌培养阳性组的喂养方式、抗生素应用时间及抗生素应用种类与艰难梭菌培养阴性组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 艰难梭菌毒素A/B PCR检测 检测19例艰难梭菌培养阳性粪便中的毒素A和毒素B，其中毒素A阳性3例，毒素B阳性2例，毒素A/B的检出率为26.32%。

2.3 患儿艰难梭菌抗原和毒素联合快速检测 见表3。

表3 检测艰难梭菌方法

表3结果表明，快速试剂盒抗原的艰难梭菌检出率与厌氧培养比较，Kappa值是0.571，一致性较好，差异无统计学意义(P=0.706)；毒素PCR扩增检测毒素A/B阳性率与快速试剂盒抗原/毒素检测比较，Kappa值是1，有极好的一致性，差异无统计学意义(P=1)。

3 讨论

艰难梭菌是一种产芽孢的格兰阳性杆菌，是引起抗生素相关腹泻的常见病原菌。由于广谱抗生素在儿科的广泛应用，儿童艰难梭菌感染的发病率不断增高，已成为医院感染最重要的病原菌，引起了人们的广泛关注[6]。本研究发现非母乳喂养患儿艰难梭菌检出率明显高于母乳喂养，与国内外报道一致。母乳中含有丰富的分泌性IgA和其他抗体，可以和病原菌结合，防止感染；另外，母乳喂养的婴儿肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌群含量丰富，这些益生菌可形成竞争阻力，抑制艰难梭菌[7]。长时间多种抗生素联合应用也是艰难梭菌感染的危险因素，大量应用广谱抗生素可以破坏肠道菌群平衡，肠道内正常定植菌减少，艰难梭菌乘机大量繁殖。据报道儿童一个月内使用3种以上抗生素发展为严重的艰难梭菌感染概率明显增加[8]。

婴幼儿有较高的艰难梭菌定植率，其中大多数为非产毒株，并不引起肠道炎症。据报道婴幼儿艰难梭菌定植率约为35%，刚出生的1周的新生儿就有艰难梭菌定植，0～1月、1～6月、6～12月和3岁以上的儿童艰难梭菌定植率分别为37%、30%的、14%和0～8%[6]。本研究中厌氧培养+毒素A/B PCR扩增艰难梭菌检出率为29.2%，产毒株为7.69%；快速试剂盒检测艰难梭菌检出率为33.8%，产毒株为7.69%，同国内外文献报道一致。可见婴幼儿艰难梭菌携带者以非产毒株为主，多数无临床表现。目前对于儿童艰难梭菌定植率高的原因尚无定论，Jangi等[9]认为婴幼儿处于肠道菌群的形成时期，缺少成人肠道中拟杆菌和厚壁菌等有益菌群，这些菌群可形成“定植阻力”，抑制艰难梭菌的定植。Fallani等[10]发现母乳喂养与配方奶喂养的婴儿相比较，其体内双歧杆菌等优势菌群占优势，类杆菌数量较少且艰难梭菌检出率明显较低。再次，小儿免疫系统未发育成熟，肠内相应受体缺乏，艰难梭菌毒素缺乏作用靶位，不能引起相应的炎症反应，可能与艰难梭菌在儿童中高定植率有关[11]。

检测艰难梭菌的方法主要包括厌氧培养、组织细胞培养、细胞毒素试验、酶联免疫法和PCR等。艰难梭菌的厌氧培养通常用环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂选择培养基，需要严格的厌氧环境，花费时间长，通常需要3～4 d才能得到结果[12]。PCR的法分别检测A、B毒素，操作比较繁琐，所需时间长[13]。艰难梭菌在繁殖过程中可产生谷氨酸脱氢酶(GDH)和毒素，用于ELISA法检测粪便中GDH和毒素，简单快速。本研究选用厌氧培养后PCR扩增及快速酶联免疫荧光法试剂盒进行检测，结果显示两种方法有较高的一致性。

综上所述，婴幼儿虽然有较高的艰难梭菌携带率，其中大多数为非产毒株，并不引起肠道炎症。酶联免疫法检测GDH抗原和毒素，与厌氧培养+毒素PCR扩增法相比有较好的一致性，并且操作简单可以作为艰难梭菌感染的筛选。

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(本文编辑：李志文)

The analysis of clostridium difficile colonization and infection in infants with diarrhea

GUO Yanan,WANG Jun,LI Jiayao，WANG Qiuping，LIU Xinzhu.

China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029，China

Objective To investigate clostridium difficile bacteria colonization and infection in infants with diarrhea and discuss the testing methods.Methods The cases and feces of infants with diarrhea were collected in pediatric digestive outpatient from 2014 to 2015.We detected clostridium difficile bacteria and toxins in the feces by anaerobic culture,toxin A and B PCR amplification method,and enzyme-linked immunosorbent assay.Results Of 65 specimens,19 cases(29.2%) were positive for anaerobic culture.The A/B toxin were positive in 5 cases(6.2%) in the 19 cases by PCR amplification.Antigen was positive in 22 cases(33.8%) by enzyme-linked immunoassay detection,and there was no statistically significant difference when compared with anaerobic culture.Toxin A/B was positive in 5 cases(6.2%), and there was no statistically significant difference when compared with PCR amplification method.Conclusion Infants have higher clostridium difficile colonization rate,and the majority does not produce toxins and does not cause diseases.Enzyme-linked immunoassay detection for clostridium difficile antigen and toxins can be used for clinical screening.

Diarrhea； Clostridium difficile； Infants

100029 北京，中日友好医院儿科(郭亚楠，王君，王秋萍，刘欣竹)；100073 北京，北京协和医院检验科(李佳垚)

郭亚楠(1989-)，男，硕士研究生。研究方向：中医药治疗儿科疾病

王君，E-mail：junw20042003@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.06.019

R723.11

A

1674-3865(2016)06-0607-03

2016-06-23)