急性肺损伤实验动物模型的特征和评价方法

刘泽茹，宋 磊，李 丹

( 吉林大学第一医院 呼吸内科，吉林 长春130021)

急性肺损伤实验动物模型的特征和评价方法

刘泽茹，宋 磊，李 丹*

( 吉林大学第一医院 呼吸内科，吉林 长春130021)

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是指心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性、缺氧性急性呼吸衰竭。急性肺损伤最严重的情况就是急性呼吸窘迫综合征[1]。流行病学调查显示ALI /ARDS是临床常见危重症，其发病机制目前尚不清楚，缺少敏感、特异的指标，使得治疗上的总体预后改善并不大，因此动物模型为研究急性肺损伤提供了较大帮助。目前研究急性肺损伤的动物模型有鼠类、兔、犬、猪、绵羊、山羊及灵长类等动物，但由于动物和人的肺部解剖结构和对抗损伤的防御机制不同，比如人类急性肺损伤是弥漫性肺泡损伤(DAD)，以炎症反应、肺泡间隔增厚、透明膜形成为主要特征[2]，而动物模型并不能复制这种病理特征，因此关于导致动物急性肺损伤的主要因素在科学界还未达成共识，人类急性肺损伤定义的标准也不能直接复制到大多数的急性肺损伤的动物模型中。本文主要对急性肺损伤动物模型的主要特征及其评价方法进行总结。

1 急性肺损伤动物模型的特征

理论上，急性肺损伤动物模型应该具备一项或多项人类急性肺损伤的特征，包括损伤后急性起病(数小时)、肺生理功能障碍(如气体交换异常，肺顺应性降低)、肺组织学损伤(内皮细胞、间质、上皮)和肺泡毛细血管膜通透性增加。目前，任何一个实验动物模型都未能完全复制人类急性肺损伤的所有特征[3]。因此，明确与急性肺损伤相关的动物和人类之间的某些差异并对其进行比较尤为重要。

由于人类和动物的肺在解剖结构和生理功能上的不同，对急性损伤性刺激的反应亦不相同，因而对肺损伤的评价产生很大的影响。例如，小鼠的呼吸频率(250-300 次/分)远高于人类的呼吸频率(12-16次/分)，致使绝对呼吸频率不能作为评价小鼠急性肺损伤的指标。啮齿类动物的肺和人类的肺在大体和显微上有重要区别，当出现急性肺损伤时，在肺泡毛细血管膜通透性明显增强的情况下小鼠的肺很少出现典型的透明膜[4]。另外，人类与啮齿类动物炎症反应中的细胞和体液的关键元素也有重要差异。例如，小鼠循环的中性粒细胞(10%-25%)比人类(50%-70%)少且不表达的防御素[5]。此外，对ALI/ARDS危重病人设置的许多干预措施在动物实验中很难复制，如长时间通风或血流动力学支持等。

实验动物研究常使用年轻无合并症的老鼠，而人类肺损伤常见于老年人合并有多种疾病如糖尿病、冠状动脉疾病、肾或肝功能不全等。鉴于这些因素的不同，无法预期人类和动物的肺对同种有害刺激的反应是否相同。

2 急性肺损伤动物模型的评价方法

实验性急性肺损伤最主要的特征包括组织学损伤，肺泡毛细血管屏障改变，炎症反应和生理功能障碍；确定急性肺损伤是否发生，至少需要下述4项特征中的3项。

2.1 组织损伤的测量

组织损伤被认为是急性肺损伤最相关的特征。为了方便鉴别暴露在灌注区域的肺组织，可以在灌注剂中添加胶体碳(1∶100稀释)；胶体碳被常驻巨噬细胞吞噬后在细胞内出现黑点，可用于鉴别灌注剂是否进入食道。肺间隔厚度的评价依赖整个肺的膨胀性，由于技术的缺陷或气道结构差异导致部分区域充气不足，此区域肺组织切片肺间隔通常是增厚的。因此，只有肺间隔增厚大于或等于两倍正常肺组织才在评价范围之内。此外，评价肺间隔厚度时不应选择邻近血管或气道的肺组织进行测量，由于支气管血管胶原蛋白的存在这些部位的肺间隔通常是增厚的[6]。

2.2 渗透性变化的测量

大型动物如绵羊和山羊，可以收集肺淋巴液并测定淋巴液和血浆总蛋白浓度，两者的正常比值约为0.50。油酸、内毒素、细菌，或酸吸入等危险因素使肺血管和上皮细胞通透性增加，淋巴液和血浆中的总蛋白比值通常不变。毛细血管通透性的变化也可用伊万斯蓝染料测定，这种方法因可在不使用放射性同位素的情况下测定渗透性而被广泛使用。测定肺水含量也可计算湿干比重，对于体积非常小的肺，测量中微小的误差就会导致湿干比出现很大变化。炎症和肺上皮细胞产生的蛋白质对支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度也有影响。动物肺水肿液的收集也可作为一种测量方法[7，8]，在实验或临床肺水肿的早期阶段(第1个30 min)收集水肿液，则水肿液的总蛋白浓度可以与时间匹配的血浆样本进行比较。如果该比率大于0.65，则反映了渗透率的增加。如果肺水肿液样本收集于肺泡水肿发生后15-30 min，期间肺水肿液发生重吸收，这时肺泡蛋白浓度的测定结果将对肺水肿的发生产生误导作用。

2.3 炎性反应的检测

急性肺损伤常伴有肺部的炎症反应。炎症的检测包括支气管肺泡灌洗液(BAL)总中性粒细胞，髓过氧物酶(MPO)，炎性因子的检测[9]。支气管肺泡灌洗液的中性粒细胞很容易通过流式细胞仪运用特异性抗体Ly6G[10]识别。MPO被激活的中性粒细胞释放，因此，检测支气管肺泡灌洗液中的MPO可作为肺泡活化中性粒细胞积累的替代。另外，整个肺组织MPO计量反映肺组织中性粒细胞的聚集，从而可作为支气管肺泡灌洗液中性粒细胞检测的有效补充[11]。

2.4 气体交换的测量

肺损伤模型中低氧血症、肺-动脉氧分压差增加被认为与生理功能障碍最相关。因此，在评估动物是否发生肺损伤时不能将氧合作为唯一的指标。在急性肺损伤的动物模型中，氧合可能会随平均气道压力的变化而变化，亦可随胸壁扩张度或体位变化而改变(例如，俯卧位与仰卧位)[12]。PaO2的降低未必意味肺损伤的恶化，却可能提示血流动力学的恶化。体积相对大的动物测量动脉血气较容易，体积小的动物(例如，小鼠)测量动脉血气相当困难，特别是在实验过程中需要反复进行测量时，且实验动物模型受到一些因素影响，这些因素可能与ALI无关，包括镇静的程度，疼痛，体温，酸-碱平衡等。

3 常见的急性肺损伤模型

检索最近五年的文献，高潮气量或高峰值压力的机械通气，内毒素的肺部或全身给药，吸入或滴注活菌为动物肺损伤的三种最常用的应用模型。

3.1 机械通气致肺损伤模型 肺组织损伤通常表现为肺间隔增厚，肺泡中性粒细胞浸润，透明膜常出现于大型的实验动物模型，在大鼠或小鼠中很少出现。机械通气模型中通过增加肺湿-干比重和微滤过系数可导致水及蛋白质渗透性增加，并可在支气管肺泡灌洗液检测到白蛋白或总蛋白浓度增加[13]。过度通气所致血氧饱和度下降通常在数小时内即可导致严重的低氧血症。大型动物对手术的耐受性好，机械通气方面采用的较多[14]。随着科技的进步，人类使用的呼吸机可广泛应用于小型动物，这为今后开展小型动物急性肺损伤实验进一步研究提供了帮助。

3.2 内毒素致急性肺损伤模型 内毒素致伤模型多采用脂多糖[15]。通过吸入、气管内滴入，或静脉滴注脂多糖导致肺组织损伤，通常在1 h内出现肺泡、间质中性粒细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡腔水肿及蛋白质的积累[16，17]。内毒素致组织损伤依据肺泡及间质炎症、出血、肺水肿、肺不张、透明膜形成和细胞凋亡评分[18，19]。肺湿干比重的增加，伊万斯蓝染液在肺中的积累，白蛋白和总蛋白在支气管肺泡灌洗液中的积聚表明内毒素使蛋白和水的渗透性增加[20]支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目的增加，MPO活性增高、细胞因子水平增加及肺炎症反应几乎是各类型内毒素引起的肺损伤模型的炎症反应的特征[20，21]，但低氧血症很少出现。

3.3 活菌致肺损伤 制备活菌致肺损伤实验动物模型常使用雾化吸入或直接将活菌灌入鼻腔、气管或支气管等方法。实验动物模型的肺组织损伤常伴有肺泡和间质中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚和肺透明膜形成[22]。炎症标志物、肺泡灌洗液中性粒细胞数增加、MPO活性和细胞因子水平增加及全身性低氧血症，普遍存在于活菌诱导的肺损伤中。

4 结论

急性肺损伤是临床常见的难治性并发症之一，建立理想的急性肺损伤动物模型是了解ALI/ARDS发病机制和探索其治疗方法的重要手段，目前，任何一种动物模型都不能充分复制出人类ALI/ARDS的全部特点，因此，选择ALI的动物模型需要考虑每种模型的特点，以及与人类之间的差异性之后再做出决定。实验动物模型仍存在很多限制，但随着对急性肺损伤研究的深入，试验方法不断改进，动物模型的建立将更趋于完善，将对治疗和预防ALI的发生与发展有重要的指导作用。

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本文受国家自然科学基金面上项目(81570002)与国家自然科学基金青年项目(81500051)资助

*通讯作者

1007-4287(2017)06-1100-03

2016-10-19)