三种复方中药对亚慢性氟中毒大鼠脂质过氧化物清除能力的影响*

柳 青, 袁筑华, 申惠鹏, 黄朝晖, 王 丹, 成锦芳, 黄德远, 喻茂娟**

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004; 2.遵义医药高等专科学校, 贵州 遵义 563002; 3.贵州省疾病预防控制中心， 贵州 贵阳 550004; 4.北京市通州区永乐店镇卫生院， 北京 101105; 5.贵阳市第一人民医院, 贵州 贵阳 550002)



·基础研究·

三种复方中药对亚慢性氟中毒大鼠脂质过氧化物清除能力的影响*

柳 青1, 袁筑华1, 申惠鹏2, 黄朝晖1, 王 丹3, 成锦芳4, 黄德远5, 喻茂娟1**

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004; 2.遵义医药高等专科学校, 贵州 遵义 563002; 3.贵州省疾病预防控制中心， 贵州 贵阳 550004; 4.北京市通州区永乐店镇卫生院， 北京 101105; 5.贵阳市第一人民医院, 贵州 贵阳 550002)

目的： 比较3种中药方剂对亚慢性氟中毒大鼠脂质过氧化物的清除能力，探讨中药复方制剂治疗慢性氟中毒的机制。方法： 224只SD大鼠分为正常对照组、中氟组、高氟组和高氟低蛋白低钙组，后3组大鼠给予相应含氟饲料或低蛋白低钙饲料喂养制作亚慢性氟中毒大鼠模型；造模180后，中氟组、高氟组及高氟低蛋白低钙组大鼠又分为模型组、甲方剂组、乙方剂组和丙方剂组，后3组大鼠给于相应中药方剂治疗90 d；观察各组大鼠实验过程中的体重增长、氟斑牙情况，并与中药治疗90 d时取肝脏和肾脏制作组织匀浆检测过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。结果： 各模型组组织匀浆CAT含量均高于正常对照组(P<0.05)；在给予丙方剂治疗后，各个治疗系列中肝/肾组织匀浆CAT含量都有所降低(P<0.05)，说明丙方剂对降低CAT水平有作用，即能提高脂质过氧化物的清除能力；各模型组肾脏组织匀浆MDA含量高于正常对照组(P<0.05)；给予甲方剂和乙方剂治疗后，肝/肾组织匀浆MDA含量有所降低,说明甲方剂和乙方剂对降低MDA水平有作用，即能提高脂质过氧化物的清除能力，其中乙方剂较甲方剂效果更好。结论： 丙方剂能调节CAT含量的能力，使其能恢复到清除H2O2的正常范围；甲方剂和乙方剂可抑制MDA含量升高，其中乙方剂最好。

中草药； 氟中毒，牙； 大鼠,Sprague-Dawley； 脂质过氧化作用

氟中毒在世界范围内都有流行，中国的某些地区是地氟病重度流行地区。氟中毒对全身各系统都有损害，高氟引起机体自由基水平增高是氟中毒时各系统损伤机制中的关键环节。正常情况下，自由基的产生和清除处于一个平衡的代谢状态，然而某些情况下产生过多的活性氧，则自由基就会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)引起一系列氧化过程，即脂质过氧化(lipid peroxidation，LP)。氟元素可刺激多形核白细胞(PMN)发生呼吸爆发，消耗氧气，释放超氧阴离子自由基(·O2)和一氧化氮(NO)，造成脂质过氧化物堆积，因此可通过脂质氧化物的清除能力来评价中药复方制剂对氟中毒的治疗效果。脂质过氧化中间产物为丙二醛(MDA)，测定血清(或血浆)、肝脏及肾脏组织中的MDA都可以反映体内脂质过氧化程度。机体中的过氧化物酶系是清除这些过氧化物的酶，其中过氧化氢酶(CAT)所占比例最大，占过氧化物酶系的40%，但是高水平的CAT可以催化H2O2和Cl-生成氧化能力更强的次氯酸，因此过高的CAT表明机体过氧化物的增加，肝脏及肾脏组织中CAT水平可作为间接评价机体内脂质过氧化物水平的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂与药品 氟化钠(NaF，分析纯，成都市联合化工试剂研究所)，中药甲方剂的主要成分有黄芪、当归、海风藤、金钱草等，乙方剂的主要成分有杜仲、山茱萸、螃蟹、土鳖等，丙方剂的主要成分有杜仲、枸杞、党参、茯苓、金钱草等，均由遵义医药高等专科学校生产，CAT和MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。

1.1.2 主要仪器 PXJ-1B型数字式离子仪(江苏江分电分析仪器厂)，CJJ-781型磁力搅拌器(江苏金坛市环保仪器厂)，232型参比电极、PF-1型负离子选择电极(上海精密科学仪器有限公司)，MQX200超级酶标仪(BIO-TEKINSTRUMENTS.INC)，Costar 3590型酶标板(上海源叶生物科技有限公司)。

1.1.3 实验动物 选用断乳两周的纯系Wistar大鼠224只，平均体质量(91.1±10.3)g，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及制作氟中毒大鼠模型 造模前大鼠适应性喂养1周(动物室相对湿度50%～60%)后，随机将224只大鼠分为4组，正常对照组8只，中氟组、高氟组、高氟低蛋白低钙组各72只，后3组分别食用不同氟含量的食物，自由饮用自来水，每周观察大鼠生长发育状况及牙齿变化情况以判断大鼠是否出现亚慢性氟中毒。氟中毒模型大鼠自由食用NaF饲料，参照文献[1-2]制作氟中毒大鼠模型，高氟组染氟剂量为100 mg/kg，中氟组染氟剂量为50 mg/kg，高氟低蛋白低钙组染氟剂量与高氟组相同、但饲料中蛋白含量及钙含量减半(高氟组饲料)。将氟加入饲料中：每千克饲料中加入NaF 110.5 mg，饲料中氟含量即为50 mg/kg；每千克饲料中加入NaF 221.1 mg，氟含量即为100 mg/kg。

1.2.2 治疗 染毒180 d后开始中药治疗，甲方剂大鼠每天的剂量为1.94 mg/g，乙方剂为3.51 mg/g，丙方剂为3.62 mg/g。中药干粉用蒸馏水配制成混悬液，每天按1 mL/100 g 经口灌服，每周灌服6 d，连续灌服90 d。中药治疗阶段动物分组：正常对照组8只，中氟组、高氟组及高氟低蛋白低钙组再分为1个非治疗组18只和3个中药方剂治疗组各18只分别灌服3种中药。

1.2.3 观察指标 观察实验过程中各组大鼠的进食量、体重增长情况、牙齿等一般情况，造模及治疗270 d时处死大鼠，取肝及肾脏，称重后生理盐水冲洗，按1∶9加入预冷生理盐水，分别制成组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清1.5 mL，4 ℃保存备用。用比色法[3]检测CAT，硫代巴比妥酸荧光法[4]检测MDA。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠生长发育状态

实验期间，大鼠一般状态良好，各模型组进食量较对照组减少。染毒阶段前4月，各实验组的体重增长均较对照组缓慢，其中高氟低蛋白低钙组的体重增长比对照组、中氟组和高氟组都慢，差异有统计学意义(P<0.05)；染氟前4月，各组大鼠每月的体重都比上月增长，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 染氟期各组大鼠体质量变化±s)Tab.1 Weight of rats during the exposure period

(1)与同组前1个月比较,P<0.05;(2)与高氟低蛋白低钙组比较,P<0.05

2.2 氟斑牙

染氟1个月左右，高氟组大鼠开始出现轻度氟斑牙，釉质表面出现黄白相间条纹改变；染氟期末，除正常对照组外，其它各组均出现程度不同的氟斑牙，且随染氟剂量升高，氟斑牙损伤明显加重，甚至下齿尖部可见明显的磨损；各模型组氟斑牙发生率均高于正常对照组，高氟低蛋白低钙组氟斑牙发生率比中氟组高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 染氟期各组大鼠氟斑牙情况Tab.2 Dental fluorosis results of the exposure period

(1)与对照组比较P<0.05，(2)与中氟组比较P<0.05

2.3 肝脏和肾脏组织中CAT含量

肝脏及肾脏组织匀浆的CAT含量作为肝脏和肾脏的清除脂质过氧化物的指标之一。肝脏清除脂质过氧化物指标: 各模型组肝脏组织匀浆CAT含量均高于正常对照组(45.22±5.99)U/g，差异有统计学意义(P<0.05)。中氟治疗系列和高氟治疗系列各组大鼠肝脏CAT水平，只有丙方剂组大鼠CAT水平低于模型组(P<0.05)。高氟低蛋白低钙治疗系列中，乙方剂组和丙方剂组CAT低于高氟低蛋白低钙模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，肾脏清除脂质过氧化物指标：各模型组肾脏组织匀浆CAT含量均高于正常对照组(42.11±14.83)U/g有统计学意义(P<0.05)。中氟治疗系列和高氟治疗系列各组大鼠肾脏CAT水平，只有丙方剂组大鼠CAT水平低于模型组(P<0.05)。高氟低蛋白低钙治疗系列中，乙方剂组和丙方剂组CAT低于高氟低蛋白低钙模型组有统计学意义(P<0.05)，见表3。

治疗后肝肾组织匀浆CAT含量的变化提示丙方剂有降低CAT含量，提高清除脂质过氧化物的能力。在各方剂之间，各组丙方剂肝脏/肾脏CAT活性均低于甲方剂和乙方剂，差异有统计学意义(P<0.05)，丙方剂降低CAT活性方面好于其他两个方剂(见表3)。

表3 各组大鼠肝脏CAT活性Tab.3 CAT assay in liver results of the rats between the drug groups

(1)与未治疗比较，P<0.05；(2)与甲方剂比较，P<0.05；(3)与乙方剂比较，P<0.05

2.4 肝脏和肾脏组织匀浆MDA含量

肝脏及肾脏组织匀浆的MDA含量作为肝脏和肾脏的清除脂质过氧化物的指标之一。肝脏清除脂质过氧化物能力指标：各模型组肝脏组织匀浆MDA含量均高于正常对照组(15.46±2.31)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。高氟治疗系列和高氟低蛋白低钙治疗系列中，甲方剂组和乙方剂组肝脏MDA含量均低于高氟模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。肾脏清除脂质过氧化物能力指标：各模型组肾脏组织匀浆MDA含量均高于正常对照组(48.72±11.70)μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。高氟治疗系列和高氟低蛋白低钙治疗系列中，甲方剂组和乙方剂组MDA含量均低于高氟低蛋白低钙模型组有统计学意义(P<0.05)，见表4。

治疗后肝肾组织匀浆MDA含量的变化提示甲方剂和乙方剂均有降低MDA含量，提高清除脂质过氧化物的能力。各方剂之间，高氟低蛋白低钙治疗系列乙方剂肝脏MDA含量低于甲方剂，差异有统计学意义(P<0.05)；高氟和高氟低蛋白低钙治疗系列中乙方剂肾脏MDA含量低于甲方剂，差异有统计学意义(P<0.05)。提示乙方剂在清除脂质过氧化产物方面效果好于甲方剂，见表4。

表4 各组大鼠肝脏和肾脏MDA活性测定结果Tab.4 MDA assay in liver results of the rats among the drug groups

(1)与未治疗比较，P<0.05；(2)与甲方剂比较，P<0.05；(3)与乙方剂比较，P<0.05

3 讨论

本次实验以NaF饲料饲养Wistar大鼠270 d，实验观察发现，大鼠在染氟后出现了不同程度的活动减少，体重增长缓慢等现象。慢性氟中毒对动物最为显著的影响是氟斑牙，因此氟斑牙常常作为判断建立氟中毒模型成功与否以及防治氟中毒效果的可靠指标之一。实验结果显示，各模型组出现了不同程度的氟斑牙，且正常对照组并未出现氟斑牙，提示已成功地复制出了亚慢性氟中毒大鼠模型。亚慢性氟中毒大鼠的肝肾CAT、MDA含量均高于正常对照组大鼠，提示亚慢性氟中毒大鼠体内脂质过氧化物水平确实发生了改变。在复方中药治疗亚慢性氟中毒效果上，丙方剂降低CAT活性方面好于其他两个方剂，甲方剂、乙方剂在清除MDA方面都有较好的效果，其中乙方剂更好。根据预实验发现，在染毒90 d后，高氟染氟组开始出现氟斑牙，提示90 d开始出现氟中毒症状，持续染毒180 d后，再对成功建立的亚慢性氟中毒大鼠进行中药治疗。在治疗90 d后，各组清除脂质过氧化物的相关指标(CAT含量、MDA含量)趋于稳定。

CAT是一种酶类清除剂，又称为触酶，以肝脏中含量最多，但在细胞中过氧化氢酶多存在于微体，胞浆和线粒体中却很少。CAT以铁卟啉为辅基，一分子中含有4个铁原子[5]，形成血红素的活性位点，并处于高度自旋的Fe3+状态，可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的损害。CAT虽不是脂质过氧化产物，但可催化H2O2和Cl-形成一种强烈的氧化剂和氯化剂，即次氯酸，其活力强于H2O2100倍[6]。所以较低的CAT活力对减轻机体组织氧化和细胞损伤有着积极的作用。有研究发现，氟中毒非干预组髓过氧化物酶(MPO)酶活力均显著高于干预组和对照组[7]。CAT是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%，研究过氧化物酶可间接反映CAT含量。另外，Fe参与过氧化氢酶、过氧化物酶的合成，同时也是人体造血所必须的主要微量元素，并与乙酰辅酶A、琥珀酸脱氢酶、细胞色素还原酶的活性密切相关[8]。如今，对氟中毒状态下体内Fe含量的变化说法不一。氟虽然不能直接影响铁的代谢，却会导致细胞内脂质过氧化作用增强，细胞受到损伤，而损伤的细胞内Fe、Cu、Zn含量和比值发生了改变，使Fe、Cu含量增加[9]。有研究表明，活性铁是脂质过氧化的催化剂，铁与巯基结合有很强的催化作用，在铁离子催化下可产生活性很强的自由基(·OH)和其他氧化剂，提示铁过载的病理变化与自由基形成有关[10]。氟中毒高铁状况，势必会提高CAT活性，引发脂质过氧化反应的增强。丙方剂可能调节体内微量元素间的比例，使铁含量恢复正常，从而降低CAT活性。

MDA是脂质过氧化过程中中间产物，可交联蛋白质和磷脂的氨基，影响膜流动性，使膜脆性增加，其含量的变化可间接的反应组织中氧自由基含量的变化。甲方剂、乙方剂提高抗氧化力的同时还可减少脂质过氧化物含量。

综上所述，中药复方的作用机制可减少脂质过氧化物的产生，或清除其中间产物，对减轻氟中毒的高氟状态有一定作用。

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(2016-09-06收稿，2016-11-16修回)

中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 赵 毅

A Study on Chinese Medicine Formula Enhancing Elimination Lipids Peroxide Capacity of Chronic Fluorosis Rats

LIU Qing1, YUAN Zhuhua1, SHEN Huipeng2, HUANG Zhaohui1, WANG Dan3,CHENG Jinfang4, HUANG Deyuan5, YU Maojuan1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563002,Guizhou,China; 3.GuizhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,Guizhou,China;4.HealthCenterofTongzhouDistrictYongleTowninBeijingCity,Beijing101105,China;5.TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,Guizhou,China)

Objective: To explore the effect of three Chinese medicine formulae which may enhance ability of eliminating lipid peroxide of chronic fluorosis rats, and discuss relevant mechanism. Methods: 224 rats were divided into 4 groups: control group, medium-dose fluorine group, high-dose fluorine group, high-dose fluorine supplemented with low protein and low calcium diet group. The latter three groups were fed with fluorine containing feed or low protein low calcium feed, in order to produce sub chronic fluorosis rats; after model producing for 180 days, the latter three groups were further divided into model group, prescription A group, prescription B group and prescription C group. These three new groups were treated with traditional Chinese Medicine formula for 90 days; observing weight gain and dental fluorosis condition, and make tissue homogenate to test CAT activity and MDA content with liver and kidney after 90days of treatment. Results: Compared with control group, the CAT of positive control group was increased which was statistically significant (P<0.05). After given treatment of prescription C, CAT in both liver and kidney had been decreased implying prescription C is effective for decreasing the level of CAT, which enhanced ability of eliminating lipids peroxide. Compared with control group, the MDA content of model groups were higher than that of control group(P<0.05). After given treatment of prescription A and B, MDA in both liver and kidney had been decreased implying prescription A and B are effective for decreasing the level of MDA, which enhanced ability of eliminating lipids peroxide, meanwhile prescription B is more effective than prescription A. Conclusion: Prescriptions C are able to adjust the content of CAT, and make it back to the normal range to eliminate H2O2. Prescription A and prescription B are able to restrain the content of MDA, prescription B is more effective.

drug,Chinese herbal; fluorosis,dental; rats,Sprague-Dawley; lipid peroxidation

国家自然科学基金(81560511)

时间：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.016.html

R285.5; R5999.9

A

1000-2707(2016)12-1393-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.006

**通信作者 E-mail:maojuanyu@gmc.edu.cn