光动力学疗法对真菌生物膜的作用研究进展

张莉 李秀丽

(同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海 200072)

·综述·

光动力学疗法对真菌生物膜的作用研究进展

张莉 李秀丽

(同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海 200072)

生物膜是一种附着于活组织或无活力组织的表面、由菌体产生的细胞外多聚基质包裹的有结构的菌细胞群体。近年来，有研究表明随着真菌耐药性的增加，65%的感染与生物膜的形成有关，光动力疗法作为一种新型非侵入性疗法，具有精确靶向特性，已广泛用于实体肿瘤的治疗，目前人们发现其对真菌生物膜的治疗方面有良好的前景。该文就光动力疗法对真菌生物膜的作用进行综述，旨在让大家对光动力抗真菌治疗有一个全面深入的了解。

光动力疗法；真菌；生物膜；耐药性

1 光动力学疗法的概念及光动力学疗法的作用机制

1.1 光动力学疗法的概念

光动力学疗法 (photodynamic therapy)是一种新型的光疗方法，包括系统和局部应用光敏化合物，该光敏化合物可优先被靶细胞所吸收，然后以可见光对皮损进行选择性照射。简单地说就是利用光敏分子产生的细胞毒性氧自由基达到治疗目的的一种技术。

1.2 光动力疗法的作用机制

光动力疗法必要组成部分包括：光敏化的光源、外源性光敏剂、组织氧和靶器官。首先，光敏剂进入细胞体内或者黏附到细胞表面，然后通过特定波长的光激发光敏剂,传递能量给氧气进而产生活性氧,从而诱导细胞器的光化学损伤，最终导致细胞凋亡[1]。

2 真菌生物膜的形成过程及其耐药性

各种真菌的生物膜形成过程不尽相同，但大致可以分为以下几个步骤：①菌体与支撑物表面的黏附；②形成微菌落，微菌落融合并形成生物膜的基底层；③基质的产生和释放，同时随菌丝或假菌丝的形成；④结构逐渐复杂，发育为成熟的生物膜；⑤真菌从生物膜上脱落，形成新的生物膜。近年来，由于复杂的生物膜结构的形成，真菌的耐药性也大大地增加。有研究表明，真菌形成生物膜以后，对两性霉素B和氟康唑的敏感性降低了20～100倍[2-3]。关于耐药机制的研究也很多，主要归纳为生物膜细胞外基质抑制了抗真菌药物的扩散使其无法进入生物膜内部，特殊基因的表达，代谢活动减缓，小部分亚细胞群的出现，细胞膜组成的改变[4-5]。

3 光动力疗法对真菌及其生物膜的作用

3.1 对生物膜形成的作用

光动力疗法可以有效阻碍生物膜的形成。Soares等[6]体外实验研究证实PDT在抑制芽管和生物膜形成、降低念珠菌对口腔上皮细胞黏附性方面效果明显，经TBO-LED介导的光动力疗法处理后，对氟康唑耐药的白念珠菌IB05和热带念珠菌CG09的菌落形成单位分别减少了Log10 3.54和Log10 1.95，同时还阻止了61%和66%白念珠菌对口腔上皮细胞的黏附。Khan等[7]用XTT实验证明经过24 h的治疗，亚甲蓝光动力疗法可以抑制81.9%的生物膜的形成，同时结合纳米金颗粒的话，可以抑制95.4%的生物膜的形成。

Dovigo等[8]用结晶紫染色实验来处理标本，发现经光动力疗法处理过的标本生物膜的生物量明显低于阴性对照组，也就表明光动力疗法可使部分生物膜从支撑物表面脱离。Soares等[9]以隐球菌为实验对象，用甲苯胺蓝结合发光二极管的光动力疗法做体外实验得到相似的结论。

3.2 对基因表达的作用

近年来，研究发现白念珠菌，新生隐球菌，烟曲霉等真菌生物膜的形成过程错综复杂，受多种调控机制的影响。并且真菌生物膜细胞的基因表达与浮游细胞不同。以白念珠菌为例，在白念珠菌生物膜中，分泌性天冬氨酸蛋白酶 (SAP)，磷脂酶B (PLB),脂肪酶 (LIP)，菌丝壁蛋白1 (Hwp1)，凝集素样序列 (ALS)等基因在白念珠菌生物膜中持续表达，且与游离菌相比，其中大部分基因表达水平有所上调[10]。

分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶是白念珠菌产生的胞外酶的两大家族,SAP具有较高的蛋白酶水解活性，可通过降解黏膜表面的多种保护分子 (如黏蛋白等)为白念珠菌生长提供营养，同时增加其黏附和侵入能力。磷脂酶则可促进白念珠菌在体内的入侵、存活和致病，还可逃避宿主的免疫防御机制。细胞外脂肪酶的作用为真菌获取营养消化脂类，黏附宿主细胞和组织，协同与其他酶的相互作用，通过影响免疫细胞启动炎症反应和通过溶解竞争菌群达到自我防御的目的。nailis等[11]研究已经证实与悬浮态相比，存在SAP5，LIP9，PLB2的过度表达。

Fernanda等[12]研究了亚甲蓝介导的光动力疗法对以上基因的表达情况的影响。结果表明SAP5基因的表达减少了60%，LIP9和PLB2基因的表达减少了50%，但与对照组相比并没有显著地统计学差异。该实验证明以亚甲蓝为光敏剂的光动力疗法对基因的表达仅有轻微的作用。该项研究首次阐明光动力疗法对念珠菌生物膜基因表达的影响，此方面的工作仍需要进一步的探究。

3.3 对生物膜内菌体的影响

光动力学疗法是一种细胞毒性治疗方法,它能引起细胞凋亡或坏死。ShiH等[13]以白念珠菌为实验对象，用LIVE/DEAD Fungalight Yeast Viability Kit包括PI和STYO 9来评估生物膜内细胞的生存能力，并对死菌和活菌进行定量研究，其中SYTO 9可通过所有真菌的细胞膜并将其染成绿色，而PI仅可通过受损的细胞膜，并替换出SYTO9将其染成红色。避光染色15 min，置于激光共聚焦显微镜下观察可见，对照组只可见绿色荧光的活菌，经ALA-PDT处理后，死菌数量明显增加，视野逐渐变为红色，当光照达到300 J/cm2时，抑菌效果最明显，抑菌率达到74.45%。有作者得到了相似的结论，Gao L等[14]以镰刀菌属和外瓶霉属真菌为研究对象，发现亚甲蓝介导的光动力疗法可以有效抑制悬浮态和生物膜状态的真菌的生长，同时还得出光动力疗法可以大大降低抗真菌药的最低抑菌浓度，从而预测此方法将有望缩短治疗时间，降低药物剂量，和减少药物毒性，但仍需大量的体内和临床试验来证实。

郭庆玲等[15]则在透射电镜下观察念珠菌生物膜超微结构，发现经过5-氨基酮戊酸光动力疗法处理后出现细胞变形、细胞器溶解及胞浆内空泡性变等现象。由于许多光敏剂都可以通过细胞膜，并进行不同的亚细胞定位，当使用一定波长的可见光照射时，一些细胞内成分将被活性氧的氧化产生细胞器溶解，细胞变形等现象，从而影响细胞的功能和代谢，最终引起细胞凋亡[16]。

Dovigo等[8]利用体外实验来评估姜黄素介导的光动力疗法对真菌生物膜代谢活性的影响，结果证明当姜黄素的浓度40 μM，光照能量18 J/cm2时，白念珠菌、平滑念珠菌和热带念珠菌的代谢活性分别降低了85%、85%和73%，同时生物膜的生物量也有所下降。Dovigo另一项研究也得到了类似的结论[17]，但是也发现光动力疗法对巨噬细胞也有一定的杀伤作用，巨噬细胞的代谢活性也下降了86%。针对这个缺点，有人发现使用特殊的抑制剂可以提高光动力疗法的选择性，从而降低其对宿主正常细胞的毒性[18]。

3.4 对生物膜结构的作用

生物膜是有机的三维结构，以新生隐球菌为例，用共聚焦激光扫描显微镜 (CSLM)观察其生物膜的形成早期可见酵母细胞和出芽孢子在载体表面形成单层结构，中期逐渐形成菌落，成熟期产生大量荚膜多糖和细胞外物质，将大量酵母细胞连成三维网状结构[19]。有作者用扫描电镜观察PVC材料表面白念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的结构，也发现了复杂的多层次网状生物膜[20]。生物膜复杂的空间网状结构使得抗真菌药物无法直接作用于内部的真菌。一些研究表明，光动力疗法不仅可以直接杀伤生物膜内的细胞，也可以破坏生物膜的结构[21-22]。

孙红英等[23]通过CLSM观察可以明显发现，经过不同光剂量的光照后，生物膜结构随剂量增加而逐渐疏松。当光剂量为100 J/cm2时，生物膜结构开始疏松，真菌菌丝缩短。当光剂量为200 J/cm2时，生物膜结构更加疏松，菌丝逐渐断裂。当光剂量达300 J/cm2时，生物膜结构基本消失，真菌呈现微菌落分布。通过CLSM自带的三维成像立体分析生物膜平均厚度，发现实验组中生物膜厚度随光照剂量增加而减少，其他处理组生物膜厚度基本不变。Khan等[7]的研究也得到同样的结果，发现经纳米金装载亚甲蓝介导的光动力疗法处理后，实验组出现生物膜的短缩，菌丝破裂和生物膜规则空间三维结构的消失。

4 展 望

生物膜导致多种病原真菌耐药性的提高，使临床感染的治疗效果下降，已成为临床最棘手的问题之一。各国科学家的研究内容也转向不依靠抗生素和其他细胞生物学传统方法抗真菌感染。光动力疗法将不同波长的可见光照射光敏剂杀灭真菌，安全可靠，而且可以消除生物膜上的病原体。未来新型光敏剂的研发及其代谢问题，新型光敏剂对不同微生物的靶向性问题，激光光源最适应光敏剂的波段选择，机体对光动力治疗过程中产生的过敏反应问题等，这些方面如果能进一步研究和解决，会是一个硕果累累的研究方向。

随着机制的阐明、实验条件的优化，相信在不久的将来，光动力疗法将应用于临床，成为治疗耐药真菌感染性疾病的新疗法。

[1] Donnelly RF,McCarron PA,Tunney MM.Antifungal photodynamic therapy[J].Microbiol Res,2008.163(1):1-12.

[2] Chandra J,Mukherjee PK,Leidich SD,et al.Antifungal resistance of candidal biofilms formed on denture acrylic in vitro[J].J Dent Res,2001.80(3):903-908.

[3] Ramage G,Vande WK,Wickes BL,et al.Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2001.45(9):2475-2479.

[4] Frade JP,Arthington-Skaggs BA.Effect of serum and surface characteristics on Candida albicans biofilm formation[J].Mycoses,2011.54(4):e154-162.

[5] d'Enfert C.Hidden killers:persistence of opportunistic fungal pathogens in the human host[J].Curr Opin Microbiol,2009.12(4):358-364.

[6] Soares BM,da SDL,Sousa GR,et al.In vitro photodynamic inactivation of Candida spp.growth and adhesion to buccal epithelial cells[J].J Photochem Photobiol B,2009.94(1):65-70.

[7] Khan S,Alam F,Azam A,et al.Gold nanoparticles enhance methylene blue-induced photodynamic therapy:a novel therapeutic approach to inhibit Candida albicans biofilm[J].Int J Nanomedicine,2012.7(6):3245-3257.

[8] Dovigo LN,Pavarina AC,Carmello JC,et al.Susceptibility of clinical isolates of Candida to photodynamic effects of curcumin[J].Lasers Surg Med,2011.43(9):927-934.

[9] Soares BM,Alves OA,Ferreira MV,et al.Cryptococcus gattii:in vitro susceptibility to photodynamic inactivation.Photochem Photobiol,2011,87(2):357-364.

[10] Nailis H,Kucharikova S,Ricicova M,et al.Real-time PCR expression profiling of genes encoding potential virulence factors in Candida albicans biofilms:identification of model-dependent and-independent gene expression[J].BMC Microbiol,2010,10(4):114.

[11] Seneviratne CJ,Jin L,Samaranayake LP.Biofilm lifestyle of Candida:a mini review[J].Oral Dis,2008,14(7):582-590.

[12] Freire F,de Barros PP,da SAD,et al.Evaluation of gene expression SAP5,LIP9,and PLB2 of Candida albicans biofilms after photodynamic inactivation[J].Lasers Med Sci,2015,30(5):1511-1518.

[13] Shi H,Li J,Zhang H,et al.Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms:An in vitro study[J].Photodiagnosis Photodyn Ther,2016.15(9):40-45.

[14] Gao L,Jiang S,Sun Y,et al.Evaluation of the Effects of Photodynamic Therapy Alone and Combined with Standard Antifungal Therapy on Planktonic Cells and Biofilms of Fusarium spp.and Exophiala spp[J].Front Microbiol,2016.7(8):617.

[15] 郭庆玲,孙红英,马晓娟,等.5-氨基酮戊酸光动力疗法对白念珠菌生物膜超微结构的影响[J].中国激光医学杂志,2016,25(5):254.

[16] Pereira GF,Maisch T.Photodynamic inactivation for controlling Candida albicans infections[J].Fungal Biol,2012.116(1):1-10.

[17] Dovigo LN,Pavarina AC,Ribeiro AP,et al.Investigation of the photodynamic effects of curcumin against Candida albicans[J].Photochem Photobiol,2011.87(4):895-903.

[18] Chabrier-Rosello Y,Giesselman BR,De Jesus-Andino FJ,et al.Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida[J].J Photochem Photobiol B,2010.99(3):117-125.

[19] Martinez LR,Casadevall A.Specific antibody can prevent fungal biofilm formation and this effect correlates with protective efficacy[J].Infect Immun,2005.73(10):6350-6362.

[20] 陈颖,王小燕,赵光强,等.聚氯乙烯材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察[J].中国修复重建外科杂志,2015,29(05)：609-614.

[21] Collins TL,Markus EA,Hassett DJ,et al.The effect of a cationic porphyrin on Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].Curr Microbiol,2010.61(5):411-416.

[22] Kishen A,Upadya M,Tegos GP,et al.Efflux pump inhibitor potentiates antimicrobial photodynamic inactivation of Enterococcus faecalis biofilm[J].Photochem Photobiol,2010.86(6):1343-1349.

[23] 孙红英,史航,张慧,等.ALA-PDT对体外构建白色念珠菌生物膜的影响[J].中国激光医学杂志,2014,23(05)：249-250.

R

B

1673-3827(2017)12-0318-03

张莉，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:1984587991@qq.com

李秀丽,E-mail:xiuixu_li@126.com

2016- -

[本文编辑] 王 飞