三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立

蒋素华, 程喜梅, 宋彩霞, 许申平, 梁 芳, 崔 波*

(1.郑州师范学院生物工程研究所, 郑州 450044; 2.河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002; 3.郑州拓洋实业有限公司, 郑州 450001)

实验方法与技术
ExperimentalMethod&Technology

三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立

蒋素华1, 程喜梅3, 宋彩霞2, 许申平1, 梁 芳1, 崔 波1*

(1.郑州师范学院生物工程研究所, 郑州 450044; 2.河南农业大学生命科学学院, 郑州 450002; 3.郑州拓洋实业有限公司, 郑州 450001)

本文根据GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷叶病毒(SPLCV)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、延伸温度、模板浓度、引物浓度进行改良优化,建立能同时检测3种甘薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出SPVG、SPLCV和SPFMV特异片段,其大小分别是800、276和570 bp。测序结果表明,扩增出的3种病毒序列与相应参考序列相似性达到98%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测cDNA的量为0.1 ng。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品进行检测,结果显示该方法可以特异、快速、灵敏地同时检测3种甘薯病毒。这些研究结果可为甘薯病毒检测提供参考。

甘薯; 病毒; 多重RT-PCR

甘薯病毒病存在于世界各个甘薯产区[1]。甘薯作为无性繁殖的作物,主要通过薯块和秧蔓进行繁殖,因此极易感染病毒并且代代相传。甘薯受到病毒侵染后,正常的生理机能受到严重的干扰和破坏,造成种性退化与产量的降低[2]。

病毒的检测是防治甘薯病毒病的关键,建立高效的病毒检测技术是抗病性早期鉴定、种苗检疫、确保甘薯无毒化栽培的前提[3-4]。现在常用的以病毒侵染特性为基础的检测有多种方法如目测法、指示植物法、电镜观察法、血清学检测法及分子生物学方法。分子生物学法既适用于DNA和 RNA 病毒,又适用于类病毒,具有特异性强、灵敏度高、适用面广、快速简便的特点。PCR技术目前已成为甘薯病毒检测最常用和最主要的方法之一。近年来,研究者将多重RT-PCR技术运用到甘薯病毒检测之中,与普通PCR检测方法相比,多重RT-PCR检测技术能够在一个反应体系中同时检测多种病毒,缩短了检测时间,降低了试验成本,提高了检测效率,简化了试验步骤[5-6]。目前能够检测包含甘薯卷叶病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)、甘薯G病毒SweetpotatovirusG(SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒Sweetpotatofeatherymottlevirus(SPFMV)的多重RT-PCR 反应体系少有报道。本研究建立并优化了检测3种病毒的多重RT-PCR技术,旨在为甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断打下良好的基础。

1 材料方法

1.1 材料

供试甘薯样品为采自河南地区带有典型病毒病症状的样品；阳性对照为经PCR验证含有SPVG、SPLCV和SPFMV的样品;阴性对照是无毒组培甘薯苗。样品经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞、LB固体培养基和液体培养基由本实验室制备并保存。TaqDNA聚合酶、dNTPs、M-MLV反转录酶购自TaKaRa(大连)公司;克隆载体pGEM-Teasy、多重PCR扩增试剂盒、植物总RNA抽提试剂盒、普通琼脂糖DNA回收试剂盒、IPTG、X-Gal购自天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

根据GenBank中报道的甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷叶病毒(SPLCV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)[7]的外壳蛋白(CP)基因的保守区域,应用DNAMAN软件进行序列比对分析,并应用Primer Premier 5.0引物设计软件分别设计病毒的特异性引物(表1),引物由上海英潍捷基生物技术公司合成。

1.4 单一RT-PCR检测

参照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的说明反转录合成第一链cDNA,并于-20℃保存。以cDNA为模板,分别利用SPVG、SPLCV、SPFMV的特异引物对甘薯样品进行PCR扩增。单一RT-PCR反应体系为:10×PCR buffer 2.0 μL,dNTPs(2.5 μmol/L)2.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,模板cDNA 1.0 μL,补足ddH2O至20 μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性40 s,53℃退火40 s,72℃延伸40 s,35个循环;最后72℃延伸10 min,4℃保存。 PCR反应结束后,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,利用凝胶成像仪观察并拍照记录。

表1 甘薯病毒的特异性引物

Table 1 Specific primers for sweet potato viruses

病毒Virus引物Primer引物序列(5'→3')Primersequences扩增长度/bpFragmentlengthSPVGG-FG-RGCAGGAAAAACAGGAAACACTGTAGACCATACCTCGGCA800SPLCVLCV-FLCV-RTCCAGGACTATGAGTTCAAGATGCAGTAGTGGGCTCATTGTCGTA276SPFMVFMV-FFMV-RGCGTGATACGAGCAAAGAAAAGGCCAAAAGGGGCATTTACAGCACC570

1.5 多重RT-PCR检测体系优化和建立

在同一个PCR反应体系中加入3对引物同时进行PCR,对多重RT-PCR体系中模板浓度(12、20和28 ng/μL)、退火温度(51、53和55℃)、延伸温度(68、70 和72℃)、引物浓度(2.0、6.0和10 μmol/L)等因素进行优化试验。在设定某一影响因素时,其他因素保持不变。

1.6 灵敏度检测

取1 μL浓度为1 021 ng/μL的总cDNA按10倍梯度依次稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,得到cDNA浓度依次为1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL,取1 μL cDNA为模板分别进行单一RT-PCR和多重RT-PCR扩增,观察电泳结果,分析单一PCR和多重RT-PCR检测的灵敏度。

1.7 PCR产物的克隆与序列分析

多重RT-PCR扩增产物采用普通琼脂糖DNA回收试剂盒进行回收与纯化,纯化后的PCR产物与pGEM-Teasy载体进行连接转化大肠杆菌,经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆,获得的阳性克隆送上海英潍捷基生物技术公司进行测序。利用NCBI上的BLAST和DNAMAN软件对序列进行比对分析。

1.8 多重 RT-PCR的初步应用

从田间采集7份感病甘薯样品,采用优化的多重RT-PCR方法进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 单一RT-PCR检测结果

用SPVG、SPLCV、SPFMV特异引物分别对相应病毒的RNA模板进行单一RT-PCR扩增,分别能够扩增出800、276和570 bp特异性条带,符合设计病毒目的条带大小(图1)。

2.2 多重RT-PCR反应体系的优化分析

分别对3种病毒的模板浓度、退火温度、延伸温度、引物浓度进行优化(图2)。模板浓度为12、20、28 ng/μL时,3种病毒都能扩增出目的条带且较亮,综合考虑,模板浓度可选择20 ng/μL。3种病毒引物浓度优化试验发现,当3种(SPVG、SPLCV、SPFMV)引物混合浓度为10.0 μmol/L时,结果显示SPFMV片段较强,3种引物混合浓度分别为2.0和6.0 μmol/L时,3种病毒扩增条带均较亮,为了节约成本,选择引物浓度为2.0 μmol/L。

图1 单一PCR检测三种甘薯病毒Fig.1 Detection of three sweet potato viruses by single PCR

图2 多重RT-PCR反应体系优化Fig.2 Optimization of multiplex RT-PCR reaction system

退火温度试验结果显示,退火温度为53℃时,3种病毒的目的条带均较亮,条带单一;退火温度为51和55℃时,SPVG目的条带亮度较暗,综上分析可知,53℃为最适退火温度。延伸温度试验表明,3个延伸温度均能扩增出3种病毒清晰目的条带,但是延伸温度为72℃时目的条带最亮,所以选择72℃作为最佳延伸温度。

2.3 多重RT-PCR反应体系的确立

根据2.2的结果,多重RT-PCR反应的最佳体系为:10×Primer mix (2.0 μmol/L) 1.2 μL,10×Multi buffer 2.5 μL,Super pure dNTPs (2.5 μmol/L) 2.0 μL,Multi HotStart DNA polymerase 1 μL, cDNA (20 ng/μL) 1 μL,补ddH2O至25 μL。最佳反应条件为:95℃预变性15 min;94℃变性30 s,53℃退火90 s,72℃延伸90 s,40个循环;最后72℃延伸10 min。利用建立的反应体系对SPVG、SPLCV、SPFMV进行多重RT-PCR扩增,3种病毒的目的条带均清晰分明。

2.4 灵敏度检测

将甘薯cDNA模板按照10倍梯度依次稀释，并分别取1 μL在相同反应体系及反应条件下进行单一RT-PCR和多重RT-PCR，结果表明，采用单一RT-PCR检测SPLCV、SPFMV和SPVG，其cDNA的最低检测量分别为0.001、0.01、10 ng(图3a～c)；而采用多重RT-PCR检测，在模板量为0.1 ng时能检测到3种病毒，且条带清晰(图3d)，综上多重RT-PCR检测灵敏度为0.1 ng。多重RT-PCR较单一RT-PCR检测灵敏度高。

图3 单一和多重RT-PCR 灵敏度的检测Fig.3 Sensitivities analysis of the single and multiplex RT-PCR

2.5 RT-PCR 产物的克隆及测序

分别切胶回收SPVG、SPLCV、SPFMV的 RT-PCR 产物,与PGEM-Teasy连接后转化DH5α,经蓝白斑的筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。将测序结果与NCBI上报道的病毒基因序列对比,SPFMV扩增产物与NCBI上报道的EU021058.1,EU021062.1的序列同源性达到98%,SPVG的RT-PCR扩增产物与NCBI上报道的KC771335.1, JQ775879.1序列同源性达到99%,SPLCV的扩增产物与NCBI上报道的KP069469.1,KJ013566.1的序列同源性达到99%。

2.6 田间样品检测

利用优化后的多重RT-PCR体系检测田间甘薯样品(图4)。田间甘薯样品多为几种病毒复合性侵染。检测结果表明,样品2、5、6和7为SPVG、SPLCV、SPFMV复合侵染,样品1、3为SPLCV、SPFMV侵染,样品4受SPVG侵染严重,受SPLCV和SPFMV侵染较轻。本研究建立的多重RT-PCR方法可快速、高效地检测侵染甘薯的3种病毒。

图4 甘薯田间样品检测结果Fig.4 Detection results of field sweet potato samples by multiplex RT-PCR

3 结论与讨论

中国不仅是甘薯种植大国,也是甘薯种质资源保存大国。无论是甘薯生产还是种质资源的保存,建立高效、灵敏的检测技术将为中国甘薯抗病毒育种,病毒病害防治,脱毒和无病毒甘薯种薯生产提供有效的检测手段[8]。由于甘薯易受多种病毒复合性侵染,单一RT-PCR的检测技术只能检测一种病毒,并费时费力[9]。随着分子病毒学的发展,多重RT-PCR技术和多重实时荧光定量PCR技术将成为甘薯病毒检测的良好发展方向。

由于多重RT-PCR是在同一反应体系中对多个病毒同时进行特异性扩增,并不是单一RT-PCR简单的混合,其稳定性没有单一RT-PCR高,需要针对引物、反应体系和反应程序进行综合优化和反复试验才能使多重 RT-PCR检测体系达到稳定的状态[10-12]。其中,引物选择对试验的成败起至关重要的作用, 既要使引物具有特异性,又要避免引物之间相互影响[13-15]。本研究对检测甘薯SPVG、SPLCV、SPFMV的多重RT-PCR条件进行优化,结果显示,以模板浓度20 ng/μL,退火温度53℃,延伸温度72℃,3种病毒混合引物浓度2.0 μmol/L为最佳。应用建立的多重 RT-PCR体系对7份样品进行检测,经反复验证,该体系可降低检测成本,提高检测效率,完全可用于甘薯病害田间检测。

[1] 商明清, 魏梅生. 植物病毒检测新技术研究进展[J]. 植物检疫, 2004, 18(4): 236-240.

[2] 韩盛, 向本春. 植物病毒分子检测方法研究进展[J]. 石河子大学学报(自然科学版), 2006, 24(5): 550-553.

[3] 马丽, 张春庆, 周玉亮, 等. 甘薯病毒病检测技术研究进展[J]. 中国农学通报, 2005, 21(2): 88-91.

[4] 谢逸萍, 马代夫, 李洪民, 等. 甘薯病毒检测技术的改进与组培苗病毒分布特征研究[J]. 江苏农业科学, 2003(1):32-34.

[5] 郑轩, 成巨龙, 赵震, 等. 五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBM的多重RT-PCR同步检测[J]. 植物病理学报, 2011, 41(2): 146-153.

[6] IsHak J A, Kreuze J F, Johansson A, et al. Some molecular characteristics of three viruses from SPVD-affected sweet potato plants in Egypt [J]. Archives of Virology, 2003, 148(12): 2449-2460.

[7] 张盼, 兰新芝, 乔奇, 等. 甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用[J]. 植物保护, 2013, 39(2): 86-90.

[8] 宋吉轩,陈超,李云,等.甘薯病毒病脱毒及检测[J].河北农业科学,2009,13(9):29-30.

[9] 许泳清,李华伟,邱思鑫,等.甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重RT-PCR检测方法的建立[J].福建农业学报,2014,29(11):1114-1117.

[10]Aritua V, Barg E, Adipala E, et al. Sequence analysis of the entire RNA genome of aSweetpotatochloroticfleckvirusisolate reveals that it belongs to a distinct carlavirus species [J]. Archives of Virology, 2007, 152(4): 813-818.

[11]Ateka E M, Barg E, Njeru R W, et al. Biological and molecular variability among geographically diverse isolates ofSweetpotatovirus2 [J]. Archives of virology, 2007,152(3):479-488.[12]Richard W G, Valentine A, Emmanuel B, et al. Control strategies for sweet potato virus disease in Africa [J]. Virus Research, 2004, 100(1): 115-122.

[13]Ryutaro N, Masaki M, Kaoru H, et al. An improved method of reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) to efficiently detectPotyvirus，Sweetpotatofeatherymottlevirus(SPFMV) RNA in sweet potato [J]. Journal of General Plant Pathology, 2001, 67(2): 164-168.

[14]范旭东, 董雅凤, 张尊平, 等.葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立[J]. 园艺学报, 2012, 39(5): 949-956.

[15]庞博, 刘秀丽, 张金文, 等. 马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立[J]. 植物保护, 2015,41(2): 102-107.

(责任编辑：杨明丽)

Establishment of multiplex RT-PCR system for detection of three viruses in sweet potato

Jiang Suhua1, Cheng Ximei3, Song Caixia2, Xu Shenping1, Liang Fang1, Cui Bo1

(1.InstituteofBiotechnology,ZhengzhouNormalUniversity,Zhengzhou450044,China; 2.CollegeofLifeScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 3.ZhengzhouTuoyangIndustrialCo.,LTD,Zhengzhou450001,China)

Three pairs of specific primers forSweetpotatovirusG,SweetpotatoleafcurlvirusandSweetpotatofeatherymottleviruswere designed based on the conserved region sequences of the coat protein(CP) gene published in GenBank. The crucial factors of multiplex RT-PCR including annealing temperature, extension temperature, template concentration and primers concentration were optimized and a multiplex RT-PCR detection method for three sweet potato viruses was developed. Three specific fragments could be simultaneously amplified in uniplex PCR reaction, with the lengths of 800, 276 and 570 bp, respectively. Sequence analysis indicated that the fragments of three viruses shared at least 98% homology with those of the other related viruses. Sensitivity analysis demonstrated that cDNA of 0.1 ng could be detected by multiplex RT-PCR. This multiplex RT-PCR protocol can simultaneously detect three sweet potato viruses from field samples with high specificity, rapidity and sensitivity.

sweet potato; virus; multiplex RT-PCR

2016-01-29

2016-03-07

河南省科技攻关项目(092102110128);郑州市科技计划项目(112PPTGY250-3);郑州市科技攻关项目(20150448)

S 435.31, Q 789

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.021

* 通信作者 E-mail: laocuibo@163.com