铁皮石斛茎基部2种主要病害病原菌的分离与鉴定

王国荣, 沈伟东, 孙 超, 沈肖玲, 邱春英, 苏珍珠, 楼兵干*

(1. 浙江省杭州市萧山区农业技术推广中心,杭州 311203; 2. 浙江大学生物技术研究所,杭州 310029)

铁皮石斛茎基部2种主要病害病原菌的分离与鉴定

王国荣1, 沈伟东1, 孙 超2, 沈肖玲2, 邱春英1, 苏珍珠2, 楼兵干2*

(1. 浙江省杭州市萧山区农业技术推广中心,杭州 311203; 2. 浙江大学生物技术研究所,杭州 310029)

铁皮石斛茎基部病害是铁皮石斛的重要病害,严重影响铁皮石斛的产量和质量。为了明确引起浙江铁皮石斛茎基部主要病害的病原菌,采集具典型症状的发病植株进行病原菌的分离、纯化、病原菌形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析、致病性试验结合田间症状,明确浙江铁皮石斛茎基部主要病害是由齐整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的白绢病和由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum引起的枯萎病。两种病害都侵染茎基部和茎，并最终导致整株死亡,区别是白绢病发病初期病部通常呈水渍状、褪绿、略肿大、有时伴有黄色液体渗出,后腐烂枯死;枯萎病初期茎秆褪绿、萎蔫,后缢缩干枯而死。湿度大时,前者病部遍布白色绢状菌丝体;后者病部出现白色及粉红色霉状物。

白绢病; 枯萎病; 形态学特征; rDNA-ITS; 齐整小核菌; 尖孢镰刀菌

铁皮石斛属兰科石斛属Dendrobium,是非常名贵的中药材[1],具有多重医疗保健功能[2]。野生铁皮石斛资源量少,远远不能满足市场的需求。自20世纪90年代起,浙江省在全国率先成功实现铁皮石斛产业化开发利用,2013年全省铁皮石斛产量和销量均居全国第一[3]。除浙江省外,云南、安徽、贵州、广西等省、自治区也已形成规模化生产。因石斛喜欢温暖阴湿的环境,病虫害尤其是病害越来越严重,制约了铁皮石斛产业化、规模化的发展。2013-2015年,作者对浙江省铁皮石斛种植基地的病害发生情况进行实地调查,发现造成铁皮石斛严重减产以及内在品质下降的病害主要是茎基部病害,而铁皮石斛的药用部位是茎部。在浙江萧山、义乌、建德、金华、临安、乐清等基地,茎基部病害田间株发病率达30%以上,严重的成片死亡。国内外有关铁皮石斛病害的研究基本上集中在田间调查与药剂防控方面[4],对铁皮石斛病害病原菌的研究除了黑斑病[5]和疫病[6]外,对其他病害的病原菌鲜有详尽的研究报道。如对铁皮石斛炭疽病的病原未经鉴定；对白绢病病原菌有的是经推测得到的[4]，有的报道是由不同的病原菌引起[7-8]；对镰刀菌引起的枯萎病只鉴定到属,对种名未作鉴定[4,8-9],对症状未见详尽描述,这不利于对病害采取有效的防控措施。因此,本文着重就铁皮石斛规模化栽培中发生的茎基部主要病害的病原菌进行分离鉴定,为铁皮石斛病害的绿色生态防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集及病原菌分离

2013-2015年连续在杭州市萧山区、义乌市、乐清市等地铁皮石斛基地进行田间调查,采集茎基部及茎中部的水渍状、枯萎或枯死的铁皮石斛样本,装入干净牛皮纸袋中,带回实验室。取病健交界处组织,置于75%的乙醇中1 min,再用1%NaClO表面消毒3 min,然后重新置于75%的乙醇中漂洗30 s,最后将组织块在无菌水中漂洗5次,用灭菌滤纸吸干水分并移入PDA平板上,25℃恒温培养箱内黑暗培养。待菌落长出后即从菌落边缘挑取极少量菌丝转接至新的PDA培养基上进行纯化,并在4℃冰箱内保存备用。

1.2 病原菌致病性测定

健康盆栽铁皮石斛苗由杭州正德农业开发有限公司提供,置于温室中,定时定量浇水和营养液,供致病性试验用。将分离纯化得到的代表性菌株SR1和FO2在PDA培养基上培养4～5 d后,分别采用微伤口接种法和菌丝块直接粘贴法进行接种试验:用灭菌刀片将待接种的健康盆栽铁皮石斛茎基部和距茎基部5 cm的茎上部轻轻划伤,取待测病原菌菌丝块(5 mm×5 mm),将菌丝面贴在伤口处;或者将菌丝块直接贴在铁皮石斛茎基部和距茎基部5 cm的茎部,每个处理3盆健康盆栽石斛,每盆接种6枝茎。对照组只接无菌的PDA琼脂块。将接种后的植株用塑料袋套袋保湿,置于人工气候培养室中(25℃,L∥D=12 h∥12 h,90%相对湿度)。定期观察发病情况并记录结果,待发病后从病组织处再次分离纯化病原菌。

1.3 病原菌的形态学特征观察

将分离纯化的菌株SR1、SR5、FO2和 FO6在25℃黑暗人工气候箱内的PDA平板上培养,长满平板后,观察菌落形态特征,在显微镜下观察并记录菌丝和孢子形态特征,对病原菌进行形态学鉴定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列扩增及分析

采用基因组DNA快速抽提法提取病原菌基因组DNA[10],采用核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)基因扩增通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。扩增反应总体积为40 μL,反应条件为95℃预变性2 min；94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共进行35个循环；最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段,由杭州擎科生物有限公司测序,测序结果用BLAST 软件在GenBank上进行同源性比较。

1.5 翻译延长因子EF-1α序列扩增分析和特异性引物的PCR扩增

对经rDNA-ITS序列分析确定为尖孢镰刀菌的菌株,利用翻译延长因子EF-1α引物[11]以及尖孢镰刀菌rDNA-ITS特异性引物[12]进行PCR验证,引物分别为EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′);EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)和Fo1(5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′);Fo2(5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′)。扩增反应总体积和反应条件同1.4节。PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,在紫外透射仪下检测PCR产物大小。

2 结果与分析

2.1 病害田间症状

在浙江萧山、义乌、乐清地区,铁皮石斛茎基部病害可以危害当年移植的石斛苗,也危害2～3年生的石斛植株,高温高湿的梅雨季节和夏、秋高温季节是病害的高发期,在田间有明显的发病中心,株发病率达30%以上,有的成片死亡,在病害发生过的地方,补栽的石斛苗发病率可达50%以上,常造成严重的经济损失,病害在田间可终年发生危害。

茎基部病害最终导致叶片及茎秆失绿、黄化、萎蔫、枯萎或腐烂,但不同病害的初期症状与发生部位是有区别的,按症状主要可分为两种,第一种多发生在高温高湿的梅雨季节,主要危害植株的茎基部以及根部。发病初期,近地面的茎基部呈现类似水浸状的症状,发病处黄色至淡褐色,之后病斑迅速扩展至根部,然后全株发病,叶片及茎秆黄褐色,萎蔫或腐烂。当环境湿度大时,病部布满白色绢丝状菌丝,呈辐射状延伸生长,可蔓延至根部基质(图1a)。发病后期长出褐色圆形菜籽样直径约1～3 mm的粒状菌核。该病一旦发生,植株很快腐烂和死亡。根据田间症状,作者推测该病害是由齐整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的铁皮石斛白绢病。

第二种多发生在夏、秋高温季节,主要危害植株茎秆。幼苗或新发枝感染时,植株下部叶片失绿变黄,茎秆黄化、萎蔫、枯萎(图1b),随着症状向上扩展,上部植株叶片也开始萎蔫下垂、变褐,下部叶片则开始脱落、皱缩,最后全株黄化枯萎。有的植株表现为一侧枝叶枯萎,有的茎秆基部干枯缢缩,有的茎秆中部干枯缢缩,湿度大时病株茎基部可见白色或粉红色霉状物。基于对病株症状的观察分析,作者推测该病害是由镰刀菌引起的铁皮石斛枯萎病。

图1 铁皮石斛白绢病与枯萎病症状及致病性试验结果Fig.1 Symptoms of sclerotial blight and Fusarium wilt on Dendrobium officinale and results of pathogenicity

2.2 病原菌分离及致病性测定

从病组织的根部、茎基部与茎上共分离纯化出20株菌株,据在PDA上的生长速率与菌落形态特征,将其分成两组,第一组菌株生长较快,菌丝白色,呈放射状生长,后期出现黄褐色菌核,代表菌株为SR1和SR5,组内其他菌株均有相似生长性状;第二组菌株生长较慢,菌丝白色絮状,培养基底部呈现紫色环状,代表菌株为FO2和FO6,组内其他菌株均有相似生长性状。选取上述代表性菌株进行盆栽接种试验,结果表明:微伤口法在茎基部、距茎基部5 cm处接菌株SR1和SR5 7 d后,幼嫩茎秆黄褐色水渍状略肿大,叶片失绿发黄,后见病斑上下扩展,15 d后,茎秆及叶片上可见白色菌丝,21 d后,茎秆及叶片上覆盖有大量白色绢状菌丝体(图1c),并呈放射状分布,茎基部可见深黄色菜籽状菌核,为白绢病症状。直接粘贴菌丝块的接种处理也出现相似症状,但比微伤口接种症状出现迟3～5 d。微伤口法在茎基部、距茎基部5 cm处接菌株FO2和FO6 5 d后,幼嫩茎秆的茎基部叶片失绿变黄,21 d后幼嫩枝条顶部出现枯萎症状(图1d),老熟茎秆顶部叶片出现一半叶片发黄枯萎症状(图1e),45 d后幼嫩枝条茎秆完全干枯,皱缩(图1f),此症状为枯萎病症状。直接粘贴菌丝块的接种处理也出现相似症状,但比微伤口接种症状出现迟3～5 d。菌株SR1、SR5和FO2、FO6接于距茎基部5 cm处的茎上,前者出现褪绿、肿大、腐烂后枯死,后者也出现褪绿、但不肿大、而是缢缩干枯而死。接种PDA琼脂块的对照未见侵染症状。分离并纯化感病组织处病原物,得到与SR1、SR5和FO2、FO6相同的病原菌。

2.3 分离菌株的菌落与形态学特征

菌株SR1在PDA培养基上的气生菌丝较多,菌丝密集发达,向四周呈辐射状蔓延,并形成粗壮的菌丝束,5 d左右长满直径为9 cm的平板(图2a)。12 d左右形成淡黄色油菜籽状菌核,不均匀地分布在培养基表面,30 d后变为黄褐色(图2b)。菌株SR5与SR1具有相同的菌落形态。

图2 菌株SR1在PDA培养基上的菌落形态特征Fig.2 Morphological characters of isolate SR1 on PDA

菌株FO2在PDA培养基上气生菌丝发达,突起,白色絮状(图3a)。菌落底部呈紫色环状(图3b)。10 d长满直径为9 cm的平板。显微镜下可见大型分生孢子与小型分生孢子,大型分生孢子镰刀形或月牙形(图3c),向两端较均匀地逐渐变尖,1～6个隔,大小为(21.23～32.73)μm×(3.49～5.67)μm,平均28.24 μm×4.42 μm。小型分生孢子卵圆形或肾形(图3d-1),大小为(5.17～11.35)μm×(2.16～4.80)μm,平均7.46 μm×3.74 μm。显微镜下可见其多分支状产孢结构(图3d-2)。菌株FO6与FO2具有相同的菌落特征及分生孢子形态。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列扩增及分析

分别以分离菌株FO2、SR1的基因组DNA为模板,用ITS通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,分别扩增出约500 bp及650 bp(图4a)的PCR 产物。将PCR产物提交杭州擎科生物有限公司测序。测序结果为菌株FO2的rDNA-ITS序列长度502 bp、SR1序列长度650 bp。用BLAST 软件在GenBank中进行同源性比较,结果表明,菌株FO2和SR1的rDNA-ITS序列分别与GenBank中登录号为KR708632.1的尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum和登录号为KP257582.1的齐整小核菌Sclerotiumrolfsii具有99%的相似性。根据菌株的形态和rDNA-ITS序列同源性比对结果,将菌株FO2鉴定为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum, 菌株SR1鉴定为齐整小核菌Sclerotiumrolfsii。

图3 菌株FO2在PDA上的形态学特征Fig.3 Morphological characters of isolate FO2 on PDA

图4 FO2、SR1的rDNA-ITS扩增产物及FO2的特异性引物Fig.4 rDNA-ITS amplification products of the isolates FO2 and SR1 and FO2 verification by specific primers

2.5 翻译延长因子EF-1α序列扩增分析和特异性引物的PCR扩增

用翻译延长因子EF-1α引物EF1T和EF2T以及尖孢镰刀菌rDNA-ITS特异性引物Fo1和Fo2对病原菌FO2进行PCR验证,分别得到大小约为700 bp及300 bp(图4b)的目的片段。将PCR产物提交杭州擎科生物有限公司测序。测序结果表明,EF-1α引物和尖孢镰刀菌rDNA-ITS特异性引物的产物长度分别是668 bp和320 bp,用BLAST 软件在GenBank中进行同源性比较。结果表明,菌株FO2上述两种专性引物的rDNA-ITS序列与GenBank中登录号为KR708632.1的尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum具有99%的同源相似性,进一步证实了分离菌株FO2为尖孢镰刀菌。

3 结论与讨论

通过从具有典型症状的病株上分离病原物,经致病性试验、病原菌形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析,结合田间症状观察,明确引起浙江省杭州市萧山区、义乌市、乐清市等地铁皮石斛茎基部腐烂、萎蔫死亡的主要病害是由齐整小核菌Sclerotiumrolfsii引起的白绢病和由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum引起的枯萎病。在田间这两种病害都引起茎基部、茎部枯死,两者的区别是白绢病发病初期通常呈水渍状、褪绿、略肿大、有时伴有黄色液体渗出,后腐烂枯死;枯萎病初期褪绿、萎蔫、后缢缩干枯而死。湿度大时,前者病部遍布白色绢状菌丝体,初为白色,后转为黄色,最后变为深褐色,条件合适,任何部位如根、茎、叶等均可感病;后者病部出现白色及粉红色霉状物。

研究结果表明,引起铁皮石斛白绢病的病原菌是齐整小核菌S.rolfsii,李海明等[7]和徐明全等[8]鉴定的白绢病病原菌也是齐整小核菌,而周传波和林盛[13]认为是由罗氏白绢菌Pelliculariarolfsii引起,作者在文中没有说明寄主的种名,只说是兰花白绢病。曹星星[14]从铁皮石斛茎腐病病组织中分离到砖红镰孢菌F.incarnatum和层出镰孢菌F.proliferatum,二者侵染植株后均可引起茎秆维管束变黑色或褐色环变。由尖孢镰刀菌F.oxysporum引起的铁皮石斛枯萎病并未发现引起维管束变色,且该病原菌未见前人作过分离鉴定[4,7-8]。

野生石斛在协同进化过程中与周围环境、微生物建立了某种平衡,很少发生病害。人工种植石斛主要为设施栽培,具有温度高、湿度大、空气流通差等特点,非常有利于病原菌的生长繁殖。浙江梅雨季节温度高、湿度大,加上基质过湿,通风不良,导致白绢病严重发生。目前防治白绢病主要采用甲霜·恶霉灵和苯甲·嘧菌酯[15],防治枯萎病主要采用咪鲜胺和雷帕霉素[14]。由于铁皮石斛是名贵的中药材,在栽培管理过程中应尽可能少用化肥与农药,我国大面积规模化的石斛人工种植是近5年的事,属于迅速发展的中药材。目前有关药用石斛病害的基础性研究很少,病害防治以化学防治为主,用药盲目性大,建议加强生产与科研单位的合作与配合,从病原学和病害流行学入手,研究明确病害流行发生规律,找出关键防治时期,开展绿色生态防控研究,保障石斛种植产业健康持续发展。

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(责任编辑：杨明丽)

Isolation and identification of two main basal stem pathogens onDendrobiumofficinale

Wang Guorong1, Shen Weidong1, Sun Chao2, Shen Xiaoling2, Qiu Chunying1, Su Zhenzhu2, Lou Binggan2

(1.XiaoshanAgriculturalTechnologyExtensionCenterofHangzhouCity,ZhejiangProvince,Hangzhou311203,China;
2.InstituteofBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)

The basal stem diseases are important diseases onDendrobiumofficinaleand have great impact on the yield and quality. In order to identify the pathogens of the main basal stem diseases onD.officinalein Zhejiang, we collected typical diseased plants and clarified the main basal stem diseases by pathogens isolation, purification, morphology characters observation, rDNA-ITS sequence analysis, and pathogenicity identification combined with field symptoms. The results indicated that the main diseases are southern blight disease caused bySclerotiumrolfsiiandFusariumwilt disease caused byFusariumoxysporum.Both diseases can infect the basal stem and stem, and finally caused the death of the whole plant. The differences of the two diseases are that the symptoms of southern blight usually are water soaking, chlorisis, slight swelling at the early infection stage, sometimes combined with yellow leaking liquid, and the plants become rot and then die, while theFusariumwilt shows chlorisis and wilt at the early infection stage and the plant die of drying shrinkage. With high humidity, the diseased parts infected by southern blight are full of white silky mycelium while theFusariumwilt infected plants show white and pink mold shaped substance.

southern blight;Fusariumwilt; morphology characters; rDNA-ITS;Sclerotiumrolfsii;Fusariumoxysporum

2016-03-01

2016-05-22

浙江省“三农六方”项目(N20120623)

S 435.672

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.030

* 通信作者 E-mail: bglou@zju.edu.cn