大球盖菇的分离纯化及ITS序列鉴定

张健+张国权+邹莉

摘要：以吉林长白山地区的野生大球盖菇为材料，对其进行1～5 h不同时间的晾晒处理，采用组织分离法分别对其菌盖、菌盖与菌柄交接处、菌柄上端和菌柄基部的组织进行分离纯化，通过测定菌丝生长速度、生长势和污染率等，筛选出分离纯化的最适晾晒时间和最佳部位；设置5种液体培养基配方培养液体菌种，通过测定菌丝体生物量、菌丝球密度和形态，筛选出最佳的液体培养基配方；最后将分离物进行ITS序列分析，计算遗传距离，并采用邻接法构建NJ系统发育树。结果表明，分离纯化最适晾晒时间为2 h，最佳分离部位为菌盖与菌柄交接处，此种情况下菌丝生长速度最快，菌丝长势最好，污染率最低；最佳的液体培养基配方为A2，菌丝体生物量最高，菌絲球密度最大，形态最好；最后分离菌株经ITS序列测定，系统发育分析证实其为大球盖菇。

关键词：大球盖菇；组织分离；ITS序列分析；系统发育分析

中图分类号： S646.904 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0120-03

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）别称酒红球盖菇、皱环球盖菇，属担子菌门（Basidomycota）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）球盖菇科（Strophariaceae）球盖菇属（Stropharia），是国际菇类交易市场上十大菇类之一，也是联合国粮农组织（FAO）向发展中国家推荐栽培的特色食用菌之一[1]。大球盖菇鲜菇色泽艳丽，肉质脆嫩滑爽，干品气味清香，营养丰富，具有很高的食用价值和药用价值，颇受国内外消费者欢迎，具有非常广阔的发展前景。大球盖菇的栽培管理较为粗放，对其冬闲田露地栽培[2]、大棚反季节栽培[3]、畦式栽培、层架式栽培、地坑式栽培等[4]多种栽培模式进行深入研究，对利用稻草、玉米秸秆、菌渣等不同栽培料栽培大球盖菇也进行多样化比较[5-8]，取得了丰富的研究成果，但关于大球盖菇母种的获得、液体培养基配方的筛选以及如何对菌种进行准确鉴定还未见报道。ITS（internal transcribed spacer）是核糖体内转录间隔区，包括ITS1和ITS2两部分，连同二者中间的5.8S rDNA基因组成ITS1-5.8S-ITS2结构，被广泛应用于真菌菌种鉴定、系统发育、条形码和群体多样性研究[9]。本研究对采自吉林长白山地区的野生大球盖菇进行组织分离，获取母种，筛选最适合液体菌种生长的培养基配方，并对子实体和分离菌株的ITS序列进行测序比对，构建系统发育树，旨在从分子水平上对大球盖菇进行鉴定，进而为大球盖菇的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大球盖菇子实体于2015年9月采自吉林省长白山地区。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备 研究使用的分离培养基为PDA培养基，培养基制作方法如下：将马铃薯洗净去皮，用电子天平称取200 g切成1 cm3的小块，用纱布包好后放入1 000 mL水中煮沸；待马铃薯块软化后捞出，加入葡萄糖20 g，琼脂15 g，再次煮沸，加水补足 1 000 mL；再用双层纱布过滤，倒入锥形瓶内；将瓶口用封口膜封好后，用高压灭菌锅121 ℃灭菌 20 min；灭菌结束后，待培养基温度降至不烫手但未凝固时，在超净工作台内，定量倒入直径为8 cm的培养皿中，装液量为20 mL，凝固后备用。

1.2.2 子实体晾晒时间对分离的影响 以刚采集到的部分野生大球盖菇新鲜子实体作为对照，将大球盖菇放置在充足阳光下晾晒，晾晒时间为10：00—15：00，分别取晾晒1、2、3、4、5 h的子实体和新鲜子实体进行组织分离。将菌盖从中间撕开，挑取0.3 cm大小的菌肉组织接于PDA平板培养基中心部位，每个平板接1块菌肉，盖盖后用封口膜封好，每组设置10个重复，放置在25 ℃恒温培养箱中进行培养，每天观察菌肉组织的萌发、污染以及菌丝生长情况。

1.2.3 子实体不同部位对分离的影响 将分离要使用的解剖刀、镊子、封口膜以及PDA平板放入超净工作台中进行紫外灭菌。将大球盖菇经处理后分离效果最好的子实体，用75%乙醇擦拭表面2～3遍，用无菌的解剖刀在菌盖顶部中间划口，用手撕开，注意避免手接触到内部的菌肉。用解剖刀分别在子实体菌盖、菌盖与菌柄交接处、菌柄上端和菌柄基部划取一小块组织，用无菌镊子夹起，迅速放置于制备好的PDA平板培养基中心处，每个平板接1块组织，每组设置10个重复，封口膜封口后置于25 ℃恒温培养箱中进行培养，每天观察并记录组织体的萌发情况、污染情况和菌丝生长情况。

1.2.4 液体培养基的制备 研究共采用5种液体培养基研究培养基对菌丝生长的影响，各培养基制作方法如下。

（1）基础液体培养基A1。将马铃薯洗净去皮，称取 300 g，切成1 cm3小块，用纱布包好后放入1 500 mL水中煮沸；待马铃薯块软化后捞出，加入30 g葡萄糖、1.5 g KH2PO4和0.75 g MgSO4，再次煮沸；加水补足1 500 mL，再用双层纱布过滤，倒入500 mL锥形瓶内，每个锥形瓶分装300 mL液体培养基；封口膜封口后，放入高压灭菌锅内，121 ℃灭菌 30 min 以备用。（2）加富液体培养基A2。基础液体培养基A1+15 g蛋白胨。（3）加富液体培养基A3。基础液体培养基A1+15 g尿素。（4）加富液体培养基A4。基础液体培养基A1+15 g酵母膏。（5）加富液体培养基A5。基础液体培养基A1+15 g硫酸铵。

1.2.5 不同液体培养基配方对菌丝生长的影响

1.2.5.1 菌块培养及液体培养基接种培养 将由同一子实体的同一部位分离获得的母种进行扩繁，接种于新的PDA平板培养基中心，待菌丝长满整个平板培养基后，用直径为 5 mm 灭过菌的打孔器在距平板中心接种点3 cm处打孔，将菌龄一致的菌块转接到液体培养基中，每瓶液体培养基接入菌块10块，每个配方设置5个重复。将接入菌块的液体培养基锥形瓶放入恒温振荡器内，在25 ℃、130 r/min的条件下培养10 d，观察菌丝球形态。

1.2.5.2 生物量的测定 取50 mL液体菌种，2 000 g离心20 min，去上清；菌丝体沉淀经蒸馏水充分洗涤后，滤纸过滤；待滤液无色透明后收集菌丝体，80 ℃真空干燥至恒质量，电子天平准确称质量。计算公式为：

菌丝体生物量（g/L）=菌丝体干质量（g）0.05（L）×1 000。

1.2.5.3 菌丝球密度的测定 将培养至10 d的液体菌种摇匀后，用移液器吸取1 mL的菌液，加入9 mL的无菌水中，稀释10倍，测定菌丝球个数。

1.2.6 DNA的提取 采用快捷型植物基因组 DNA 提取试剂盒（天根）分别对大球盖菇的子实体和分离培养得到的菌丝体进行基因组 DNA提取。将大球盖菇子实体撕开用灭过菌的镊子夹取内部完好的菌肉，放于研钵中，加入液氮充分研磨；菌丝体采用锥形瓶中的液体菌种，经纱布过滤后，用无菌水冲洗3～5遍，将菌丝拧干，取适量放于研钵中，加入液氮充分研磨。其余步骤参照说明书。

1.2.7 ITS序列的扩增 采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）用于rDNA ITS 区段的 PCR 扩增[10]。扩增体系为50 μL，其中35.5 μL去离子水，5 μL 10×PCR buffer，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），ITS1/ITS4 引物各2 μL，0.5μL Taq DNA 酶（5 U/μL），1 μL模板DNA（浓度 20～50 mg/L）。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃反应7 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后4 ℃保存。

1.2.8 ITS序列的测序与分析 为了保证测序的准确率，PCR产物经胶回收纯化后用正反向引物双向测序，测序由哈尔滨博仕生物技术有限公司完成。

将测序结果在NCBI中作BlastN比对，找出并下载 >90%相似性序列，用ClustalX2.1的Alignment程序对所有同源序列进行多重对位排列。用MEGA 5.02软件进行系统发育分析和进化树的构建。用Kimura2-parameter 模式计算遗传距离，所有对位排列结果中的空位（gaps）或缺失数据（missing data）作完全删除（complete deletion）处理，进化距离分析采用邻位相连法（NJ，neighbor-joining）。系统树每个分支的统计学显著性分析以自展法（bootstrap）进行检验，重复次数为1 000次。

2 结果与分析

2.1 子实体晾晒时间对分离的影响

由表1可知，分离新鲜子实体污染率达到了30%，而经过晾晒1 h，污染率降低至10%，晾晒2～5 h，污染率降为0。晾晒时间越长，萌发越慢，新鲜子实体和晾晒1～2 h的子实体分离时，萌发最快，只需2 d；晾晒5 h时，分离的菌肉组织不萌发。晾晒时间越长，菌丝生长越慢，晾晒2 h的子实体分离后，菌丝生长速度最快，为8.0 mm/d，但与新鲜子实体和晾晒1 h的子实体差别不大。新鲜子实体和晾晒1～2 h的子实体，菌丝生长浓密，长势旺盛；但晾晒3 h之后，菌丝变得稀疏，长势较弱。综上所述，采用晾晒2 h的大球盖菇子实体进行分离，既能有效地降低污染率，又不影响萌发和菌丝的生长。

2.2 子实体不同部位对分离的影响

从表2可以看出，大球盖菇子实体菌盖与菌柄交接处分离后，菌丝的生长速度最快，达到8.9 mm/d；其次是菌柄上端（8.5 mm/d）和菌盖（8.0 mm/d）；菌柄基部最慢，仅为 7.4 mm/d。除菌柄基部外，其他3个部位菌丝的长势都很浓密旺盛；菌柄基部的污染率达到了10%，其他3个部位污染率则为0。综合分析，菌盖与菌柄交接处为最佳分离部位。

2.3 不同液体培养基配方对菌丝生长的影响

如表3所示，不同的液体培养基配方上生长的菌丝存在很大差异。A2的菌丝体生物量（6.8 g/L）和菌丝球密度（138个/mL）均明显高于其他4组培养基；其次为A4培养基，菌丝体生物量为5.5 g/L，菌丝球密度为109个/mL；A3的菌丝体生物量和菌丝球密度则最小，分别为3.7 g/L、65个/mL。A2和A4配方的菌絲球如小米粒大小，呈圆球状，大小均一，菌液稠密；其他3组配方的菌丝球都如绿豆粒大小，呈刺球状，其中A1配方的菌丝球大小均一，菌液浓度较稠密；而A3和A5配方的菌丝球大小不均一，菌液浓度较稀疏。综上分析，采用A2培养大球盖菇菌丝体最佳，其次为A4培养基。

2.4 ITS区段的PCR产物及测序

对大球盖菇子实体及分离培养得到的菌丝进行DNA提取，并以提取的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1所示的特异性条带。由图1可以看出，S1与S2片段大小一致，约为650 bp，与测序得到的基因片段长度S1 （649 bp）和S2 （654 bp）大小相符，并且S1与S2有99%的同源性。由此可以初步判定，菌丝体S2为大球盖菇子实体S1的纯培养菌丝体。

2.5 系统发育分析

在NCBI中进行BLASTN比对，找到12条与S2相似性>90%的序列并下载，用ClustalX2.1软件进行序列比对，并辅以人工修正。以灵芝（Ganoderma lucidum）作为外参，基于来自NCBI中的12个种的ITS序列，连同试验中的 ITS 序列共14条序列一起用于系统发育分析。用MEGA 5.02中的邻接法（NJ）构建系统树。从图2可以看出，S2与球盖菇属大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）系统发育关系最近。

3 结论与讨论

对于野生食用菌的人工驯化，首先须要获得纯化菌种，常见的菌种分离方法有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法，其中组织分离法因简单、易操作且纯化率高，在实践中被广泛地应用[11]。本试验采用组织分离法对野生大球盖菇进行分离，试验结果表明，野生大球盖菇能够成功分离获得母种，并且子实体经2 h的晾晒，既能有效降低污染率，又不影响萌发和菌丝的生长，而长时间的晾晒则会严重抑制菌丝的萌发和生长。可能是经过适宜时间的晾晒，子实体水分减少从而减少了细菌污染，再加上阳光中的紫外线具有杀菌功能，进一步降低污染，但长时间晾晒使子实体脱水，菌丝体细胞活力减弱甚至死亡，从而影响分离效果。大球盖菇最佳的分离部位是菌盖与菌柄交接处，该部位分离的菌丝生长速度快，长势旺盛且污染率低，可能的原因是该部位是子实体的生长点，菌丝体细胞活力强，分裂速度快，且该部位与空气接触少，杂菌少。在食用菌工厂化生产中，液体菌种因其生产周期短、菌龄一致、菌种生产成本低、接种简便等优点，得到了十分广泛的应用[12]。本试验筛选出最适宜的液体培养基配方为A2，即基础液体培养基A1+蛋白胨15 g，采用此配方培养的液体菌种，菌丝体生物量高，菌丝球密度大，形态好。原因可能是此配方所含的蛋白胨中营养更丰富，氮的形态更适合菌丝体吸收。

目前菌种鉴定、遗传多样性研究主要基于形态学、细胞、生化及分子水平开展[13]，其中ITS序列分析法因准确性高，简便易行而具有很大的应用价值。本试验通过对供试子实体与菌丝体的ITS序列进行扩增、测序、比对，验证了供试菌丝体为大球盖菇子实体的分离物，構建系统发育树后发现，分离获得的纯培养菌丝体与球盖菇属的大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）系统发育关系最近，与其同源性高达99%，确定为大球盖菇菌种。

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