侧柏和国槐幼苗生长对铅胁迫的阈值

王榆鑫+王进鑫+初江涛

摘要：采用盆栽试验研究侧柏（Platycladus orientalis）、国槐（Sophora japonica）幼苗在适度供水（田间持水量的80%）条件下对重金属铅（Pb）的阈值反应，计算在适度供水条件下铅对叶绿素含量、生物量、株高生长量、地径生长量等的毒性阈值（ECx，x=10、50）。结果发现，低浓度的铅对2个树种所研究指标有促进作用，而高浓度的铅则产生抑制作用。各指标中，侧柏净光合速率EC10为262 mg/kg，即对铅的反应最为敏感；国槐对铅最敏感指标为株高，株高生长量的EC10 为667 mg/kg。2个树种叶绿素含量EC50最大，侧柏、国槐分别为11 352、10 050 mg/kg，说明该指标对铅抗性最强；其余指标对铅耐性大小依次为生物量>株高>地径。多指标综合分析得出的阈值，EC10，国槐为1 526.79 mg/kg，EC10，侧柏为1 731.62 mg/kg；EC50，国槐为9 104.59 mg/kg，EC50，侧柏为6 414.73 mg/kg。以上结果表明，在适度供水条件下，国槐幼苗对铅胁迫更为敏感且幼苗抗铅性也强于侧柏幼苗。

关键词：侧柏；国槐；铅胁迫；阈值；生理毒性

中图分类号：X503.235；X171.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0123-05

随着矿产资源开发规模的不断扩大，由此带来的土壤重金属污染问题日趋严重，其中铅引起的污染尤为普遍。大量的铅进入陆地表层生态系统，对土壤环境造成了严重污染，使得区域环境质量下降，给生态安全造成威胁。铅是最常见的对人体和植物危害最大的重金属之一[1]，可以通过植物根、茎或叶进入植物体并在其体内积累，当达到一定数量时，就会对其生长、生理生化造成不利影响[2-4]。基于铅污染的危害性和广泛性，矿业开发后的废弃地修复是环境保护工作中急需开展的任务之一[5]。

国内外有关土壤重金属对植物的毒害效应及其阈值的研究结果表明，植物种类、生长状态、土壤性质等对土壤重金属的毒害效应及其临界值都会产生影响[6-10]。在我国常用作物产量減少10%的土壤有害物质的浓度作为毒害临界浓度[11-12]，即EC10 （10%有效抑制浓度）是建立基于风险的环境质量基准值的数据基础[13]；目前对锌[14]、汞[15]等污染物毒性阈值研究较多，阈值（ECx，x=10、50）表示引起指标10%或50%抑制效应时所对应的铅浓度，关于土壤铅对作物的毒害及阈值研究已经取得了良好的进展[16]，而对西北地区常见造林树种侧柏、国槐等阈值研究目前尚未见报道。本试验研究了适度供水、不同铅浓度条件下侧柏和国槐幼苗各指标（叶绿素、株高、生物量等）的阈值大小，旨在揭示在适度供水及不同铅浓度条件下国槐、侧柏幼苗叶绿素、净光合速率、生物量、地径及株高的变化规律和2个树种耐铅性大小，为铅矿业废弃地植被恢复与土壤修复提供新的方法和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苗木为长势一致的侧柏、国槐幼苗，苗龄1年，所有苗木均来自陕西省杨陵地区附近苗圃。栽培基质为塿土（田间持水量22.3%，有机质含量13.70 g/kg，全氮含量 0.73 g/kg，速效磷含量35.90 mg/kg，速效钾含量 96.52 mg/kg，铅含量 18.41 mg/kg，pH值8.15），铅试剂为分析纯醋酸铅Pb（CH3COO）2·3H2O。

1.2 试验方法

试验在西北农林科技大学南校区进行，采用旱棚的方法进行布设，2014年1月取风干土过筛，将Pb（CH3COO）2·3H2O充分搅拌均匀混合于土壤中，制成含不同浓度的铅污染土壤，浓度分0（对照，CK）、300、500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 mg/kg，分别将13 kg的土装入直径27 cm、高30 cm的塑料桶中，每个处理3盆，每盆2株供试植物，即每个处理共6个重复。于3月底栽植，浇灌一定体积的水，保证苗木成活，采用人工称质量的方法控水，使各铅处理的土壤含水量维持在田间持水量的80%（土壤质量含水量17.8%）。在整个试验过程中，大棚内采用自然光照，栽培基质保持自然肥力。到9月中旬，测定净光合速率、地径、株高等指标，然后将2个树种各处理植株进行收获，测定生物量。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 叶绿素含量的测定 于9月14日进行叶绿素的测定，分别采集每个处理的6株侧柏、国槐幼苗叶片，具体采集的部位是每株幼苗自上而下数的第5、第6个小分枝，再将采集的叶片混匀，然后随机取样；称取0.5 g样品，将所称取的叶片用水洗净，吸干水后放入研钵中，加入少量CaCO3、石英砂，加入10 mL乙醇丙酮混合液，将样品充分研磨细碎直至变白，然后将其过滤，得到叶绿素的提取液；将过滤后的提取液用乙醇丙酮混合液定容至100 mL，用紫外分光光度计测定定容后的提取液的吸光度D663 nm、D645 nm。

1.3.2 净光合速率（Pn）的测定 采用Li-6400光合测定仪对净光合速率进行测定，在室外自然光照下测定，为减少每次测定时自然环境因子误差，于9月12日进行净光合速率的测定，测定时间为09：00—11：00，选取长势良好，树冠上部向阳的叶片进行测定。

1.3.3 生长指标的测定 分别于2014年3月栽植后，2014年9月收获前各测定1次侧柏和国槐的株高和地径；于2014年9月收获后测定侧柏和国槐的生物量。

（1）株高（新稍长度）。采用米尺（精确度0.001 m）测量。（2）地径。采用数显游标卡尺（精度0.01 mm）测量。（3）生物量。收获后，将侧柏、国槐植株根、茎、叶分开，洗净后在105 ℃杀青 30 min，70 ℃恒温烘至恒质量后称质量，得到各部分的生物量。

1.4 数据处理及阈值的確定

采用Microsoft Excel软件对所测的6个重复数据进行整理并取平均值，再进行作图，运用SPSS 19.0软件进行回归方程的拟合和差异显著性分析。通过建立数学模型来寻找污染物阈值[17]，以土壤Pb浓度和各指标（叶绿素含量、株高、地径等）为对象，采用回归分析的方法，建立土壤Pb含量（x）与各指标（y）的线性、多项式、对数、乘幂、指数5个回归模型，并进行筛选。通过比较各方程的决定系数（r2）和相关显著性检验（P值），确定采用拟合性最高（最大r2值和最小P值）的回归方程为拟合公式，进而求得各指标的EC10、EC50，最后利用SPSS软件中的因子分析确定各个指标的权重，对2个树种耐铅能力进行综合评价。权重具体计算公式如下[18]：

2 结果与分析

2.1 重金属铅对叶片叶绿素的毒害效应阈值

铅能破坏叶绿素和叶绿体的结构，从而破坏叶绿素合成过程并影响叶绿素合成酶的活性[19]，因而叶绿素含量已成为评价植物受到逆境伤害的重要生物学指标。以土壤Pb含量为因变量，以叶绿素含量为自变量，采用回归分析方法建立土壤Pb含量（x）与叶绿素含量（y）的多项式回归模型（图1）。

在适度供水条件下，国槐、侧柏幼苗叶片叶绿素含量变化的总体趋势是：随着铅含量的增加而降低，当铅含量为 12 000 mg/kg 时，叶绿素含量最低，国槐、侧柏分别为6.65、4.79 mg/g。侧柏在铅含量为1 000 mg/kg时叶绿素含量与对照相比增加了6.3%，说明低含量的铅对叶绿素的合成具有一定的促进作用（图1）。通过回归方程可求得国槐叶绿素的EC10为1 165 mg/kg，侧柏叶绿素的EC10为4 586 mg/kg，可见2个树种叶绿素含量的EC10相差较大，且侧柏EC10大于国槐EC10，就叶绿素含量这一指标国槐对铅胁迫反应更敏感；国槐叶绿素含量的EC50为10 050 mg/kg，侧柏叶绿素含量EC50为11 352 mg/kg，即幼苗叶片叶绿素含量ECx为：侧柏>国槐，同一含量下铅胁迫对于叶绿素含量的影响侧柏小于国槐。

2.2 重金属铅对叶片净光合速率（Pn）的毒害效应阈值

对土壤重金属Pb含量与幼苗叶片净光合速率（Pn）之间的关系（图2）进行模拟分析可以看出，国槐、侧柏Pn随土壤铅含量变化趋势大致相同。铅含量为0～2 000 mg/kg范围内，2个树种Pn下降较快，说明在这一范围内铅对叶绿素结构破坏严重；而铅含量2 000～6 000 mg/kg时，Pn下降趋势相对平缓，可能是因为叶绿素结构已经被破坏，所以Pn维持在一个相对较低的水平。通过计算发现，国槐Pn的EC10为 1 136 mg/kg，侧柏Pn的EC10为265 mg/kg，说明在Pn这一指标上，侧柏较国槐更为敏感；国槐Pn的EC50为4 629 mg/kg，侧柏Pn的EC50为2 202 mg/kg，表明同一铅含量对国槐幼苗Pn的影响要小于对侧柏幼苗的影响。

2.3 重金属铅对幼苗地径、株高的毒害效应阈值

地径、株高生长量均是反映植物生长状况的重要指标。随着铅含量的增加，侧柏、国槐幼苗地径生长量逐渐减小，侧柏地径生长量变化趋势与其叶绿素含量变化趋势类似，当铅含量为12 000 mg/kg时，地径生长量仅为0.54 mm，为对照的 13.74%；对于国槐在铅浓度为0～4 000 mg/kg范围内，地径生长量明显下降，说明在这一含量范围内，重金属铅对国槐地径生长量影响较大。通过拟合方程，求得国槐生长量EC10为914 mg/kg，EC50为9 620 mg/kg；侧柏生长量EC10为 1 803 mg/kg，EC50为5 730 mg/kg （图3）。

铅胁迫下，侧柏、国槐幼苗株高生长量随着铅含量的增加逐渐降低，变化趋势与地径生长量基本一致（图4）。在土壤铅含量为12 000 mg/kg时，侧柏、国槐幼苗株高生长量分别为对照的31.84%、44.64%，国槐幼苗株高生长量的EC10为 667 mg/kg、EC50为9 680 mg/kg；侧柏幼苗株高生长量EC10为1 509 mg/kg，EC50为5 937 mg/kg。以上结果表明，国槐幼苗株高生长量较侧柏对铅更为敏感。

2.4 重金属铅对生物量的毒害效应阈值

土壤铅含量与侧柏、国槐的叶、根、茎的生物量成反比（图5、图6）。当铅含量为12 000 mg/kg时，侧柏和国槐的总生物量为17.02、55.32 g，分别是对照的35.67%、42.76%。但在较低的铅含量范围内，即当铅含量为500 mg/kg时，侧柏叶的生物量为24.08 g，比对照增加3.88%；当铅含量为 1 000 mg/kg 时，国槐茎的生物量为32.33 g，比对照增加了30.56%。这说明低含量的铅对这2个树种生长有一定促进作用，与叶绿素含量的变化规律类似。对侧柏来说，茎的生物量EC10为388 mg/kg，对铅反应最为敏感，根的生物量EC50为 11 720 mg/kg；生物量EC10为：国槐>侧柏，总生物量EC10侧柏为744 mg/kg，国槐为2 692 mg/kg；总生物量EC50侧柏为 7 871 mg/kg，国槐为9 722 mg/kg，总生物量EC50为：国槐>侧柏（表1）。

2.5 重金属铅对2树种毒害效应阈值的综合分析

运用SPSS 19.0软件对铅胁迫条件下2个树种的指标叶绿素含量、净光合速率、生物量、地径生长量、株高生长量EC10及EC50进行主成分分析（表2至表5）， 提取累积贡献率大于80%的主成分，并计算权重，通过表2、表3可求得2个树种的综合EC10；通过表4、表5得到2个树种的综合EC50。

将综合模型式（14）系数归一化，得到各指标权重，即指标集（叶绿素含量EC50，净光合速率EC50，生物量EC50，株高生长量EC50，地径生长量EC50）对应的权重集为（0.093，0.119，0.245，0.280，0.263）。根据各个指标的权重，计算出侧柏、国槐的综合EC50值分别为6 414.73、9 104.59 mg/kg。

3 结论与讨论

本试验在前人研究的基础上探讨重金属铅对国槐和侧柏叶绿素含量、生物量、株高等的毒性阈值，结果表明，铅含量较低时对叶绿素的合成有一定促进作用；随着含量继续增加，对叶绿素的合成表现为抑制，这与徐勤松等的研究结果[20]基本一致。侧柏叶绿素EC10大于国槐，说明侧柏叶绿素对铅胁迫的敏感性要比国槐小；净光合速率的变化趋势与叶绿素类似。高含量的Pb破坏叶绿素的合成过程是通过使叶绿素酸酯还原酶的活性降低和减少氨基-r-酮戊酸的合成实现的，因为这2样都是合成叶绿素所必需的物质，植物的叶绿素含量少了，净光合速率也随之降低[21]；而Kupper等则认为，重金属铅影响光合作用的机理是Pb2+取代了叶绿素分子中的Mg2+，使叶绿素的结构破坏，进而对光合作用的正常进行产生影响，导致净光合速率下降；有关重金属铅影响光合作用的机理，还需要进一步的深入研究[22]。侧柏叶绿素含量EC10为国槐EC10的3.9倍，而侧柏净光合速率EC10仅为国槐的 23.06%，可能原因是国槐光能利用率更高[23]。

逆境条件下，植物能够通过调整自身的形态特征最大程度地减少环境对其生长发育的影响。大量研究表明，一定含量范围内的铅能刺激一些植物生长，当铅含量超过一定值时就会对植物造成伤害，如生长衰退等，且含量越高，抑制作用越明显[24-26]，植物的生物量、株高、地径与其生长发育、营养物质的形成密切相关。由图5、图6可知，重金属铅会抑制侧柏、国槐生物量的增加，在根、茎、叶各部分生物量中，铅对侧柏茎生物量的抑制作用最大，当铅含量为 12 000 mg/kg 时，茎生物量仅为对照的31.03%；同样铅含量下，对国槐叶生物量抑制最大，此时叶生物量为对照的 40.81%。从图3、图4可以得出，侧柏株高、地径生长量EC10均小于国槐，同种树株高、地径生长量EC10比较，株高大于地径，地径对铅耐性不如株高。运用主成分分析，并计算权重，最后得到综合EC10，国槐为1 526.79 mg/kg，EC10，侧柏为 1 731.62 mg/kg；EC50，国槐为 9 104.59 mg/kg，EC50，侧柏为 6 414.73 mg/kg，此结果表明在适度供水条件下，国槐幼苗对铅胁迫更为敏感，且幼苗抗铅性强于侧柏幼苗。

本试验未能找出铅对2种树幼苗的致死阈值，可能和所施加的铅试剂有关，杨楠通过运用不同铅制剂处理侧柏种子，侧柏幼苗茎长EC50在醋酸铅和硝酸铅作用时分别为 9 690、4 390 mg/kg，即同等条件下，相同含量的硝酸铅对侧柏影响更大；也可能是所加铅试剂浓度未能达到两者的致死浓度，还需要在以后的试验中设计更高的铅试剂浓度或更换其他的铅试剂如硝酸铅做进一步研究[27]。

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