葡萄酒苹果酸—乳酸发酵高耐受性优良植物乳杆菌直投式发酵剂的优化

张莉+段浩云+田洪涛

摘要：从葡萄酒二次发酵液中筛选的优良植物乳杆菌L42为研究对象，对菌株L42的高效直投式发酵剂进行研制。利用单因素试验和正交试验对菌株L42最佳增殖培养基、离心条件、冻干保护剂进行优化，得到植物乳杆菌L42最佳廉价培养基为番茄汁基础培养基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，培养后活菌数可达到57.8亿CFU/mL，与番茄汁基础培养基相比提高了8.41倍；最佳离心条件为6 000 r/min、10 min，离心后活菌数收得率可达99.37%；最佳冻干保护剂的配方为10%脱脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸钠、1%吐温80、0.5%酵母浸粉，冻干存活率为89.01%；冻干后的植物乳杆菌L42在11%乙醇度、130 mg/L SO2、pH值3.0的环境下能够正常增殖，将获得的直投式发酵剂于4 ℃下保存11个月后活菌数仍可达到10亿CFU/mL。

关键词：葡萄酒；植物乳杆菌；离心浓缩；冻干保护剂；直投式发酵剂

中图分类号： TS201.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0167-04

苹果酸-乳酸发酵（MLF）是乳酸菌以双羧基L-苹果酸为反应底物，在苹果酸-乳酸酶的作用下，转变成单羧基的 L-乳酸和二氧化碳的过程[1-2]。经MLF作用后，果酒中的苹果酸被分解为乳酸而达到降低酸度作用；同时乳酸菌代谢活动还可以改变果酒中的酯类、醛类、氨基酸、有机酸和维生素等微量成分的含量以及呈香物质的浓度，有利于形成酒体风味复杂性[3-4]。当葡萄酒酸度较高时，酿造出的葡萄酒口感较酸涩，须要进行MLF改善其风味[5]。

直投式发酵剂（directed vet set starters，DVS Starters）是高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵微生物菌种，因使用时不须要活化和扩培处理而受到发酵行业的广泛欢迎。目前，直投式发酵剂在欧美等发达国家得到了广泛应用[6-7]，在葡萄酒生产中得到普遍应用，而国内该领域的相关研究和应用均较少。笔者已经从自然发酵的葡萄酒中筛选得到对乙醇度、SO2浓度、pH值具有高耐受性的植物乳杆菌L42，本研究旨在通过单因素和正交试验对植物乳杆菌L42的复合增殖培养基、最适离心条件及冻干保护剂进行优化，确定适合葡萄酒二次发酵的优良植物乳杆菌高效直投式发酵剂研制参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株来源 菌种为植物乳杆菌L42，由笔者所在实验室从自然发酵的葡萄酒中分离筛选所得。

1.1.2 培养基 （1）复原脱脂乳培养基的制备。脱脂奶粉加蒸馏水制成14%复原脱脂乳液，调节pH值为6.5，0.07 MPa 灭菌10 min冷却后备用。

（2）MRS培养基。牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸二胺2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、吐温80 1 mL/L、磷酸氢二钾 2 g/L 配制固体培养基时另添加1.8%琼脂，培养基均在 115 ℃ 下灭菌20 min。

（3）番茄汁培养基。番茄汁制备工艺为：新鲜番茄、清洗、热烫（90～95 ℃，3～5 min）、榨汁→过滤（100目滤布）、调pH值至6.0，0.07 MPa灭菌30 min备用。

（4）白菜汁培养基。白菜汁制备工艺为：选取无破损、无霉烂、无虫蛀的新鲜白菜清水洗净、沥干→捣碎、打浆→过滤（100目滤布）、调pH值至6.0，0.07 MPa灭菌30 min备用。

（5）胡萝卜汁培养基。胡萝卜汁制备工艺为胡萝卜、洗净、去皮及根梢、称质量、切片→煮沸（料 ∶水=1 g ∶4 mL，100 ℃，5 min）→榨汁→过滤（100目滤布）→定容（1 kg胡萝卜生产5 L汁定义为100%胡萝卜汁）、调pH值至6.0、0.07 MPa 滅菌30 min备用。

1.1.3 仪器与设备 酸度计，PHS-3C，上海理达仪器厂；SW-CJ-1FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；JA5002型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；BCD-210C华意冰箱，中国华意电冰箱制造厂；离心机、冻干机。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 菌种分别经140 g/L复原脱脂乳液体培养基、液体MRS培养基活化，备用。

1.2.2 廉价增殖培养基的优化

1.2.2.1 基础培养基的确定 将活化菌株按1%接菌量分别接种于番茄汁、胡萝卜汁、白菜汁基础培养基中，37 ℃培养24 h，每2 h取样，测定D600 nm值，确定最佳收获期，37 ℃恒温培养至最佳收获期，采用平皿菌落计数法确定最佳基础培养基。

1.2.2.2 增殖因子的筛选 在所选的基础培养基中添加 0.2% 磷酸氢二钾的基础上分别添加1%大豆蛋白胨、1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、1%牛肉膏、0.5%酵母膏、2%乳糖、2%葡萄糖、2%蔗糖、0.5%玉米浆，制成不同增殖培养基，通过活菌数及结果差异显著性比较确定较优营养因子。

1.2.2.3 增殖复合培养基的确定 在单因素试验基础上采用正交试验设计，以活菌数为评价指标，以L9（34）正交表（表1）进行试验设计，筛选出增殖复合培养基。

1.2.3 乳酸菌浓缩分离技术 植物乳杆菌L42经液体MRS培养基活化，分别以1%（活菌数约0.01亿CFU/mL）接种于番茄汁复合增殖培养基中，37 ℃恒温培养至对数生长末期，分别采用不同离心力、离心时间浓缩分离菌体细胞，检测不同离心条件下离心前初始活菌数和离心后上清液活菌数、沉淀的活菌数，计算离心损失率、离心存活率、离心收得率，以寻求获得最高菌体收得率的离心条件。离心损失率、离心存活率、离心收得率计算公式如下。

离心损失率=上清液活菌数（CFU/mL）/初始活菌数（CFU/mL）×100%；

离心存活率=沉降细胞活菌数（CFU/mL）/[初始活菌数（CFU/mL）-上清液活菌数（CFU/mL）]×100%；

离心收得率=沉降细胞活菌数（CFU/mL）/初始活菌数（CFU/mL）×100%。

1.2.4 高效冻干保护剂 脱脂奶粉可作为乳酸菌的冷冻保护剂，糖类也是菌体在冻干时应用较为广泛的保护剂[8-9]，常用作糖类保护剂的主要有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖。它们共同点是有大量自由基，具有还原性，抗干燥保护能力较强，同时还可抑制菌表面自由基的产生[10-14]；Fuchigami等认为，海藻糖能使菌体内的水形成细小和钝圆的小冰晶，减弱了冷冻时冰晶的机械损伤作用，能稳定细胞膜和蛋白质结构，抗逆保鲜作用较强[15]。

小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过包裹形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用。

1.2.4.1 单因素保护剂的筛选 将活化后的植物乳杆菌L42，以1%（活菌数约0.1亿CFU/mL）接种于番茄汁复合增殖培养基中，37 ℃恒温培养至对数生长末期，离心收获菌体，以10%脱脂乳为基础保护剂，分别添加单糖类、多糖类、蛋白质类等多种物质在-20～18 ℃冷冻12 h，进行真空冷冻干燥，测定其活菌数计算冷冻存活率及冻干存活率。

1.2.4.2 复合保护剂的筛选 在单因素试验基础上采用正交试验设计，以活菌数为评价指标，以L9（34）正交表（表2）进行试验设计，筛选出以10%脱脂乳为基础保护剂的复合保护剂。冷冻存活率、冻干存活率计算公式如下：

冷冻存活率=冷冻后细胞活菌数（CFU/mL）/初始活菌数（CFU/mL）×100%；

冻干存活率=冷冻干燥后细胞活菌数（CFU/mL）/初始活菌数（CFU/mL）×100%。

1.2.5 菌株L42直投式发酵剂耐受性验证 将冻干后的菌株L42直投式发酵剂无菌条件下加入等量4%葡萄糖溶液复溶，以0.1亿CFU/mL的初始菌量，分别接种于不同乙醇度，乙醇度分别为9%、11%、13%；SO2浓度分别为70、100、130 mg/L；pH值分别为4.0、3.5、3.0的MRS液体培养基中，30 ℃恒温培养24 h，采用平板计数法测定不同处理的活菌数。

1.2.6 菌株冻干保护剂贮藏稳定性 将保存于4 ℃的菌株冻干发酵剂，每隔2个月测定活菌数，观察菌株在保藏期内的活菌量变化，为今后确定其保质期提供依据。

2 结果与分析

2.1 廉价增殖培养基的筛选

2.1.1 基础培养基的确定

2.1.1.1 植物乳杆菌L42的生长曲线 从图1可以看出，在37 ℃条件下，植物乳杆菌L42在3种基础培养基中培养6 h后细胞生物量开始快速增加，在6～16 h期间，菌体生物量呈对数增长，D值增长迅速，但胡萝卜汁的增长速度较番茄汁、白菜汁增长缓慢。16 h后菌株L42在3种培养基中均进入生长稳定期，此时D值达到最大，并且保持稳定状态。通常细菌在对数增长期的后期，菌体细胞的活性较强，存活率较高，因此，在适宜条件下培养13～16 h是植物乳杆菌L42细胞收获的最佳时期。

2.1.1.2 基础培养基的确定 从表3可以看出，植物乳杆菌L42在3种基础培养基中均能生长，但由于3种基础培养基的营养物质不丰富，其细胞生长量不如MRS培养基，且在3种基础培养基中，菌株在番茄汁基础培养基中的长势最好，说明3种基础培养基中番茄汁最適合菌株的生长，且与其他培养基差异极显著，所以选择番茄汁作为增殖基础培养基。

2.1.2 基础培养基增殖因子的筛选 试验以番茄汁为基础培养基，磷酸氢二钾作为一种缓冲剂添加到番茄汁基础培养基中，再添加不同的增殖因子，以期获得高活菌数，从表4可以看出，添加的不同增殖因子对植物乳杆菌L42均有不同的增殖效果，其中1%胰蛋白胨、1%蛋白胨、2%葡萄糖为最佳增殖因子，为植物乳杆菌L42提供丰富的氮源和碳源。

2.1.3 正交试验筛选植物乳杆菌L42番茄汁增殖复合培养基 根据单因素试验结果，选用L9（34）正交表进行正交设计试验，植物乳杆菌L42以胰蛋白胨、葡萄糖、酵母膏作为3个因素，参考正交表配制不同的复合培养基，从中优化筛选出植物乳杆菌L42的最佳番茄汁复合培养基。以1%接种量分别接入正交试验所设计的9种复合培养基中，37 ℃条件下培养16 h，进行活菌计数。

从表5可以看出，植物乳杆菌L42的3个因素中，最佳培养基配比为A1B3C2。即在含有0.2% K2HPO4的番茄汁基础培养基中添加0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖，植物乳杆菌L42经活化后按1%的接菌量接入该复合培养基中于37 ℃条件下培养16 h，活菌数可达到57.8亿CFU/mL，与番茄汁基础培养基相比提高了7.41倍，活菌数也提高了一个数量级。

2.2 乳酸菌浓缩分离技术

离心浓缩分离细胞是收获菌体的简便方法，多被采用。通过离心试验，可尽量减少残留在上清液中的细胞，也可改善离心力机械作用所造成的伤害，避免细胞死亡，寻求获得活细胞最高收得率的最佳离心条件。从表6可以看出，菌株L42离心损失率最高为4 000 r/min、10 min；其次是 4 000、20 min，5 000、10 min，6 000、20 min，6 000、10 min，5 000、20 min，8 000、5 min，8 000、10 min，且差异极显著（P<0.01）。

菌株L42离心收得率由低到高为 6 000、20 min，4 000、10 min，8 000、10 min，8 000、5 min，4 000、20 min，5 000、10 min，5 000、20 min，6 000、10 min。植物乳杆菌的最佳复合冻干保护剂为6 000 r/min、10 min，离心收得率可达 99.37%。

2.3 冻干保护剂的研究

2.3.1 单因素冻干保护剂的筛选 从表7可以看出，加不同保护剂的冷冻存活率和冻干后存活率差异极显著，因而从大分子糖类中选择海藻糖为最佳冻干保护剂，小分子冻干剂以谷氨酸钠、吐温80、酵母浸粉较高，具有抗冷冻作用，为较优冻干保护剂。

2.4 菌株L42直投式发酵剂的耐受性

植物乳杆菌L42经冷冻干燥后获得的直投式发酵剂对乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0的环境下能够正常增殖且与原始菌株耐受性在同一数量级上（表9至表11）。

2.5 植物乳杆菌L42直投式发酵剂保藏期的验证

菌株L42冻干发酵剂在4 ℃，11个月内活菌数呈下降趋势，但在11个月后活菌数依然可以达到10亿CFU/mL，表明选择的发酵剂可以满足直投式发酵剂的活菌数要求，在保证乳酸菌的活菌数方面具有一定的优势，并具有一定的稳定性（图2）。

3 结论

确定植物乳杆菌L42的最佳廉价培养基为番茄汁基础培养基、0.2% K2HPO4、0.5%胰蛋白胨、1.5%蛋白胨、2.5%葡萄糖；最佳离心条件为6 000 r/min、10 min；最佳冻干保护剂的配方为10%脱脂乳、10%海藻糖、1.5%谷氨酸钠、1%吐温80、0.5%酵母浸粉。在此条件下获得的植物乳杆菌L42直投式发酵剂进行稳定性研究，结果表明，该菌株直投式发酵剂在4 ℃条件下保藏11個月后活菌数仍可保持在10亿CFU/mL。经冷冻干燥后获得的植物乳杆菌对乙醇、SO2、pH值仍具有一定的耐受性，在11%乙醇、130 mg/L SO2、pH值3.0环境下能够正常增殖。

目前，我国大多数葡萄酒厂进行葡萄酒MLF依靠进口直投式活性乳酸菌或自然发酵，致使生产成本极大增加、葡萄酒质量很难保证。本研究对葡萄酒二次发酵优良植物乳杆菌L42进行高密度培养和直投式发酵剂的制备，为葡萄酒优良乳酸菌L42的大规模培养提供依据，对葡萄酒工业生产具有深远意义。

参考文献：

[1]李 华. 现代葡萄酒工艺学[M]. 西安：陕西人民出版社，1995：109-118.

[2]Davis C R，Wibowo D，Eschenbruch R，et al. Practical implications of malolactic fermentation：a review[J]. American Journal of Enology and Viticuluture，1985，36（4）：290-301.

[3]朱宝镛. 葡萄酒科学与工艺[M]. 北京：中国轻工业出版社，1992：17-18.

[4]张春晖，王 华，李 华. 苹果酸-乳酸发酵对干红葡萄酒品质的影响[J]. 西北农业大学学报，1999，27（6）：74-78.

[5]朱宝镛. 葡萄酒工业手册[M]. 北京：中国轻工业出版社，1995：170-172.

[6]Vinderola C，Mocchiutti P，Reinheimer J. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（4）：721-729.

[7]Crittenden R，Bird A，Gopal P，et al. Probiotic research in Australia，New Zealand and the Asia-Pacific region[J]. Current Pharmaceutical Design，2005，11（1）：37-53.

[8]吴雁军，刘松玲，郭慧媛，等. 直投式乳酸菌发酵剂活性影响因素的研究进展[J]. 中国乳业，2011，113（5）：52-55.

[9]Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals[J]. International Journal of Pharmaceutics，2000，203（1/2）：1-60.

[10]徐致远，刘 荣，郭本恒，等. 保护剂在乳酸菌冻干过程中的应用[J]. 乳业科学与技术，2006，29（4）：155-157，165.

[11]万红兵. 高效浓缩型酸奶冻干发酵剂制备关键技术研究[D]. 保定：河北农业大学，2006.

[12]翟硕莉. 新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究[D]. 保定：河北农业大学，2007.

[13]Bynum D G，Barbano D M. Whole milk reverse osmosis Retentates for cheddar cheese manufacture：Chemical changes during aging[J]. Journal of Dairy Science，1985，68（1）：1-10.

[14]于修维. 乳酸菌高密度培养及浓缩型发酵剂研究[D]. 南京：南京工业大学，2004.

[15]Fuchigami M，Ogawa N，Teramoto A. Trehalose and hydrostatic pressure effects on the structure and sensory properties of frozen tofu（soybean curd）[J]. Innovation Food Science&Emerging Technologies，2002，3（2）：139-147.林文秋，杨为海，邹明宏，等. 澳洲坚果果皮不同溶剂提取物的含量和抗氧化活性[J]. 江苏农业科学，2017，45（1）：171-174.