美拉德反应提高羊骨胶原肽抗氧化活性研究

杨璐，程稚玲，霍乃蕊

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西省农业科技信息中心，山西 太原 030000；3.山西农业大学 动物科技学院，山西 太原 030801)

美拉德反应提高羊骨胶原肽抗氧化活性研究

杨璐1，程稚玲2，霍乃蕊3*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西省农业科技信息中心，山西 太原 030000；3.山西农业大学 动物科技学院，山西 太原 030801)

[目的]确定还原糖种类和反应条件，通过美拉德反应提高羊骨胶原肽的抗氧化活性。[方法]研究各因素对反应产物还原力的影响，以响应面法进行数学建模，优化美拉德反应条件；用铁氰化钾还原法测定还原力时，以胶原肽液(60 g·L-1)调节零点，结果以吸光度值表示。[结果]木糖作为修饰物时美拉德反应产物的还原力显著高于葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖(P<0.01)。羊骨胶原肽与木糖在所得最优条件下反应，即木糖与骨胶原肽质量比为3∶1、反应初始pH为12、100 ℃反应3.5 h，反应产物的还原力接近于预测值，高达0.810 2。[结论]美拉德反应是提高羊骨胶原肽抗氧化活性的一种有效方法。

美拉德反应； 羊骨胶原肽； 还原力

美拉德反应是氨基化合物(氨基酸、肽和蛋白质)与羧基化合物(糖类)发生的一种羧氨反应。该反应不仅赋予食品特殊的色泽及气味，还有大量研究证实其产物具有抗氧化、抗诱变、抗病毒等特性[1]。多肽本身就具有一定的抗氧化活性，但通过美拉德反应可使其抗氧化活性进一步增强，研究者已用此法制备了抗氧化活性更强的灰树花多肽[2]、乳清蛋白肽[3]、黑蒜[4]、马氏珠母贝肉[5]和珍珠蚌抗氧化活性多肽[6]，且反应产物稳定性好，适合各类食品加工。

羊骨经过水解制备的骨胶原短肽不仅生物利用度大大提高[7,8]，且具备了抗氧化活性[9]，目前研究者多用提高水解度和短肽得率的方法提高其抗氧化活性，通过美拉德反应提高其抗氧化活性的研究甚少。本研究将以羊骨胶原肽为底物，选择合适的还原糖与其进行反应，确定最优反应条件，制备美拉德反应产物来提高其抗氧化活性[10]，为后续工业化生产提供数据支持。

1 材料

1.1 原料与试剂

羊骨胶原肽粉由内蒙古锡林郭勒盟鑫泰生物制品责任有限公司生产，经实际测定，其中的蛋白质含量为98.78%，活性低聚肽含量为96.23%，分子量分布在1 000道尔顿以下的肽占90.78%，羟脯氨酸占6.89%，灰分2.87%。

木糖购于Biotopped；葡萄糖购于天津风船化学试剂科技有限公司；乳糖购于天津市北方天医化学试剂厂；麦芽糖购于沈阳市试剂三厂；半乳糖购于天大化工实验厂；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁均为分析纯。

1.2 仪器

PSH-3型pH计(上海佑科仪器仪表有限公司)；722G型可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)等。

2 试验方法

2.1 制备工艺

以一定糖肽比将还原糖与羊骨胶原肽溶液混合，调pH，在设定水浴温度下反应一段时间，反应液冷却后5 000 r·min-1离心15 min，取上清液测定还原力。最优工艺下制备的反应产物于50 ℃烘箱中烘干，4 ℃冷藏备用。

2.2 单因素试验

将木糖与羊骨胶原肽(60 g·L-1)按照1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1的比例混合，调节pH值为6，50 ℃水浴反应3 h后终止反应，离心取上清液测定还原力，确定用于响应面试验的糖肽比；糖肽比为3∶1，调pH值为6、7、8、9、10、11、12、13，50 ℃反应3 h后测定还原力，确定pH；糖肽比为3∶1，pH 12， 50 ℃分别反应0、0.5、1.5、2.5、3.5和4.5 h，确定反应时间。调节反应温度60、70、80、90、100 ℃，其他条件同上，反应3.5 h，测定还原力，确定反应温度。

2.3 响应面设计及试验

在单因素的基础上，以还原力(Y)为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件设计试验(表1)进行美拉德反应。3因素分别是反应时间(A)、pH(B)、糖肽比(C)，其(-1、0、+1)水平分别为：A(2.5 h、3.5 h、4.5 h)，B(11、12、13)，C(2、3、4)，响应面试验设计及结果见表1。

2.4 还原力的测定

铁氰化钾还原法[11]：在1 mL的样品中加入2.5 mL的0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(pH6.6)和1%的铁氰化钾溶液，50 ℃水浴20 min后加入10%的三氯乙酸2.5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，取2.5 mL上清液加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数为1%的三氯化铁溶液，静置10 min。以60 g·L-1胶原肽液调零，在700 nm波长处测定吸光度OD值。OD值越高表示样品的还原力越大。

2.5 数据处理

采用SigmaPlot 10软件进行单因素分析、MiniTab16软件进行回归分析、Statistix 8.1进行差异显著性分析、Design-Expert 8.0.6软件进行响应面数据分析。

3 结果与分析

3.1 还原糖种类对美拉德反应产物还原力的影响

由图1可见，木糖的还原力可达到0.259 8，与麦芽糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖的还原力相比差异极显著(p<0.01)，所以本研究选用木糖对羊骨胶原肽进行修饰，与其进行美拉德反应。

图1 糖种类对美拉德反应产物还原力的影响Fig.1 Effect of reductive sugars on reducing power of Maillard Reaction products

3.2 单因素试验结果

由图2A可知，糖肽比由1∶2增加到3∶1的过程中，OD值呈上升趋势，随后随着糖肽比由3∶1到4∶1，OD值没有明显的增加，而是趋于平缓。图2B和2C可看出，随着pH从6升高到12，反应时间从0上升到3.5 h，OD值均呈上升趋势；而pH由12到13，反应时间由3.5 h增加到4.5 h时OD值开始下降。所以可看出当糖肽比达到3∶1、pH为12、反应时间为3.5 h时，OD值达到最大值。而随着反应温度的升高，还原力如图2D所示呈上升的趋势，在受试的温度范围内，100℃时还原力最大，表明在常压下，温度越高美拉德反应产物的抗氧化活性越强[12]，由此确定最佳反应温度为100 ℃。所以选择各因素的上述条件作为响应面试验的0水平。

图2 糖肽质量比、pH、反应时间和温度对美拉德反应产物还原力的影响Fig.2 Effect of ratio of peptide to xylose, pH value, reaction time and temperature on reducing power of Maillard Reaction products 注：固定因素水平为糖肽质量比3∶1、pH12、反应时间3.5 h、温度100 ℃。Note:fixed level of ratio of peptide to xylose is 3∶1, pH value 12, reaction time 3.5 hours,temperature 100 ℃

3.3 响应面法优化试验设计结果与分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对表1的数据进行多元回归拟合，得到回归方程为：

Y=0.80+(9.167E-004)A+0.070B+0.056C+(9.417E-003)AB-(9.167E-004)AC+0.025BC-0.098A2-0.23B2-0.040C2

表1 响应面试验设计及结果

表2 方差分析结果

注：*：p<0.05，差异显著；**：p<0.01，差异极显著。

Note : * and ** indicated significance at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3.4 响应面分析图

通过上述回归方程所做两两因素交互作用的响应面图曲面及等高线图(图3)可知，A、B、C对还原力的影响均表现为先上升后下降。

3.5 工艺参数优化及验证实验

利用Design-Expert 8.0.6软件计算得到最佳制备参数为：pH值为12.20，加热时间为3.51 h，温度为100 ℃，糖肽比为3.77，此时的还原力预测值为0.825 113。

考虑到实际操作，将羊骨胶原肽-木糖抗氧化美拉德产物的制备工艺调整为：pH值为12，加热时间为3.5 h，温度为100 ℃，糖肽比为3。经验证，在此条件下羊骨胶原肽的还原力为0.810 2，与预测值0.825 113相比，相对误差较小，说明响应面法优化具有必要性。因此，基于响应面法所得的的优化工艺参数具有参考的价值。

4 讨论

美拉德反应不仅可以使食品呈现更好的色香味，还会生成具有抗氧化活性的天然物质蛋白黑素[13]及中间产物还原酮和挥发性杂环化合物[14]。而美拉德反产物是食品加工和贮藏过程中自身产生的天然产物，这使其成为天然的抗氧化剂[15]。肽则是很重要的食品配料之一，其具有独特的呈味性，并且有着良好的溶解性、吸收性和抗氧化性，已广泛用于多种食品的加工及调味中。

化学合成抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)的出现推动了食品工业的发展，由于其产量大、价格低、抗氧化能力较强，作为食品添加剂更是垄断了抗氧化剂市场[16]。然而不断有人对合成抗氧化剂的安全性提出质疑，越来越多的研究表明，人工合成抗氧化剂的确具有一定毒性并有致癌作用[17]。所以开发新的、安全的、可替代BHA的抗氧化剂十分必要。作为美拉德反应的重要前体物质，肽能够与糖经加热处理形成独特的风味，增强食品风味的同时还能提高食品的抗氧化性，甚至可与BHT相媲美[18]，但在此过程中可能有潜在的不利因素产生，因此本研究的产物还有待进一步完善。

图3 两因素交互作用对还原力影响的响应面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the effect of reducing power

本研究使用的羊骨胶原肽，其中的分子量小于1 000道尔顿以下的肽占90.78%，分子量越小，肽的抗氧化化活性及其它活性就越强[19]。在进行还原力测定时，本研究以此未发生美拉德反应的羊骨胶原肽的OD值设为0，在最优工艺下制备的美拉德反应产物OD值高达0.810 2，可见其抗氧化活性进一步大幅提升,有望作为BHA的替代品，用于食品工业。

5 结论

采用Design-Expert 软件在单因素试验的基础上建立数学模型。方差分析结果表明糖肽比、pH、反应时间和温度均对还原力有影响。结合响应面分析结果和实际情况预测并验证，得到羊骨胶原肽-美拉德反应产物制备的最佳工艺条件为：糖肽比3∶1，pH值12、加热时间3.5 h 、反应温度100 ℃ 。在此条件下羊骨胶原肽的还原力(设置为0)提高到0.810 2。

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(编辑：马荣博)

Improving of the antioxidant activity of ovine ossein peptide by Maillard Reaction

Yang Lu1, Cheng Zhiling2, Huo Nairui3*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu0308011,China; 2.ShanxiAgriculturalScienceandTechnologyInformationCenter,Taiyuan030000,China; 3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The suitable reductive sugar and reaction conditions were determined in this study to improve the antioxidative ability of ovine ossein peptides by Maillard Reaction.[Methods]Based on the effect of the related factors on the reductive power, the responsive surface analysis was used to establish the mathematical models to optimize the conditions for Maillard Reaction. The reductive power was expressed by OD value and determined by the reductive method of potassium ferricyanide during which the 0 point was set by 60 g·L-1ossein peptide solution.[Results]The reductive power the resulted reaction product using xylose as decorative sugar was significantly higher than using glucose, lactose, galactose and maltose (P<0.01).The optimum condition was determined as the mass ratio of xylose to peptide was 3 to 1, the initial pH was 12, react for 3.5 h at 100 ℃，under this technology, the reductive power of the product reached to 0.810 2 which is approximately close to the predicted value of the mathematical model.[Conclusion]Maillard Reaction is an effective method to improve the antioxidative activity of ovine ossein peptide.

Maillard Reaction， Ovine ossein peptide， Reducing power

2016-08-13

2016-11-07

杨璐(1993-)，女(汉族)，山西怀仁人，在读研究生，研究方向：食品生物技术

*通信作者：霍乃蕊，教授，硕士生导师。Tel:0354-6289236,E-mail：tgnrhuo@163.com

国家自然科学基金(31201347);山西省留办留学回国人员资助项目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0115-06