莠去津高效降解菌的分离与鉴定

吕惠萍

（菏泽学院化学化工系，山东 菏泽 274015）

莠去津高效降解菌的分离与鉴定

吕惠萍

（菏泽学院化学化工系，山东 菏泽 274015）

笔者从长期使用莠去津的农田和果园的土壤中分离到3株莠去津降解菌，编号为AT-2、AT-3、AT-4。通过生理生化指标和形态分析，对AT-2以及本实验室现有的3株降解菌HB-1、HB-7、HW-4进行初步鉴定，分别为土壤杆菌属、布鲁氏菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属。测定这4株菌的降解率，反应条件为：底物莠去津浓度为100mg·L-1，反应体系5mL，5%的接菌量，恒温30℃，180r·min-1，培养24h，其降解效率分别为34.2%、37.3%、43%和40%，但在3d后，4株菌的降解率可达到90%左右。

莠去津；降解菌 ；降解率

莠去津（Atrazine）又名阿特拉津，化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，是一种选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂。但由于其残留期长(4~57周)，形成了对土壤、水体等的污染。2002年Nature上报道了莠去津在低于EPA饮用水标准的暴露剂量下,导致了非洲爪蛙性别的改变，使其以内分泌干扰物（EDC）的“身份”再次引起人们的关注[1-3]。

环境中莠去津的降解代谢可分为生物过程和非生物过程，其中生物降解代谢是去除莠去津污染的主要途径。20世纪60年代以来，许多国家均致力于寻找莠去津的高效降解微生物的研究，截止到目前，分离到的降解莠去津的微生物主要包括细菌、真菌[4]、藻类[5]等。降解莠去津的细菌主要有诺卡氏菌（N ocardia）[6]、红球菌（Rhodococcus）[7-9]等。由于莠去津对环境的污染具有全球性[10]，因而从环境中富集分离莠去津高效降解微生物，仍是今后莠去津生物修复研究的一个主要方向[11]。目前通过基因工程对细菌进行遗传修饰以满足生物修复工程的需要[12-14]是主要研究内容。本项目从受莠去津污染严重的河流、土壤中筛选莠去津高效降解菌，结合本实验室现有的菌株，采用菌株的形态结构观察法和生理生化指标法来确定其种类，并对所筛选的高效降解菌进行降解性能的初步研究，根据实验所得降解菌的形态结构和生理生化指标，参考《伯杰细菌鉴定手册》等进行鉴定[15]。

1 材料与方法

1.1 培养基、试剂与仪器

1.1.1 液体无机盐培养基

酵母浸膏1g，蔗糖3g，磷酸氢二钾1.6g，磷酸二氢钾0.4g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，2mL微量元素溶液，104mg·L-1莠去津母液10mL，去离子水1000mL；固体无机盐培养基按20%加入琼脂。

1.1.2 土样和水样

菏泽牡丹区、陕西省榆林市、潍坊寿光等地有莠去津残留的玉米地和果园内。

1.1.3 微量元素的制备

在蒸馏水中溶解ZnCl20.25g、MnSO4·H2O 1.0g、Na2MoO4·2H2O 0.25g、H3BO40.2g、FeSO4·7H2O 1.0g、CuCl2·2H20 0.25g、NH4NO3O.1g、NiSO4·6H2O 0.1g、Co(NO3)2·6H2O 0.25g，定容至1000mL。

1.1.4 仪器

生化培养箱、超净工作台、全自动立式灭菌锅、试管、玻璃平板、三角瓶、相机、高速冷冻离心机、可调式微量加样器、冰箱、漩涡振荡器、气相色谱等仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 莠去津降解细菌的分离筛选

采用直接分离法分离筛选，实验步骤：

1）取土样10g放入6个盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀，使土样与水充分混合，然后制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的土壤溶液。

2）将其中的10-1、10-4、10-6这3个稀释度的土壤溶液均匀涂布到含莠去津的无机盐固体培养基上，于培养箱内培养，出现菌落后再逐次提高莠去津的浓度进行驯化，以获得菌株的纯培养，并于4℃保存备用。

1.2.2 生理生化实验法

葡萄糖氧化发酵实验；吲哚试验；V-P试验；甲基红（MR）试验；柠檬酸盐利用；淀粉水解实验；油脂水解试验；石蕊牛乳试验。

1.2.3 降解菌的鉴定

采用稀释平板法进行菌落特征的培养，并对结果进行观察。用革兰氏及芽孢染色对菌株的个体形态进行观察。通过葡萄糖氧化发酵实验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、油脂水解试验、淀粉水解实验、吲哚试验、甲基红（MR）试验等对菌株的生理生化特征进行试验，根据《伯杰细菌鉴定手册》进行初步鉴定。

1.2.4 分离菌株莠去津降解能力的测定

从固体培养基上取单菌落接入含100mg·L-1莠去津与无机盐的液体培养基内，在30℃、200r·min-1恒温振荡器培养24h后，8000r·min-1离心收集菌体，重悬于0.9%的生理盐水，按6%接种量转入含100mg·L-1莠去津的液体无机盐培养基中,培养一定时间后，用重蒸的三氯甲烷提取，最后用气相色谱测定莠去津的残留量。

计算降解率的公式如下：

式中：X为莠去津的生物降解率，%；CX为接菌处理培养液中莠去津浓度，mg·L-1；Cck为未接菌对照培养液中莠去津的浓度，mg·L-1。

2 结果与分析

2.1 莠去津降解菌株的富集分离

从来源不同的土样和水样中分离筛选出3株细菌，可以将莠去津作为氮源进行生长，编号为AT-2、AT-3、AT-4后保存。

2.2 菌株的鉴定

降解菌株HB-1、HB-7、HW-4、AT-2的初步鉴定结果见表1。

表1 莠去津高效降解菌的生理生化特性的测定

依照《伯杰细菌鉴定手册》鉴定降解菌的种类见表2。

表2 降解菌在微生物分类系统中的种类

2.3 莠去津菌株降解性能

莠去津降解菌株的降解能力见表3。由表3可以看出降解菌在24h对莠去津的降解率在40%左右，但降解菌在3~4d左右就可以将莠去津基本降解除去。综合来看，这些菌株是很有应用前景的高效降解菌。

表3 菌株24h对莠去津的降解率

莠去津的红外谱图如图1所示。

图1 莠去津的红外谱图

3 结论

1）从有莠去津残留的土壤或受阿特拉津污染严重的活性污泥中所分离出的菌株，均可以利用阿特拉津生长且具有较高的降解能力,说明长期受莠去津污染的土壤对降解菌起到了天然富集的作用,因此从受污染的土壤中能够分离出高效降解阿特拉津的菌株。

2）根据菌株HB-1、HB-7、HW-4、AT-2菌株的形态及生理生化特征，初步鉴定为：HB-1菌株为布鲁氏菌属, HB-7菌株为葡萄球菌属，HW-4菌株为假单胞菌属，AT-2菌株为土壤杆菌属。

3）采用气相色谱对所分离菌株的降解能力进行了测定，其24h降解效率在40%左右。由此可以看出，以上分离出来的菌株有非常广泛的应用前景。

[1] 刘爱菊.阿特拉津高效降解细菌的筛选及降解性质研究[D].泰安：山东农业大学，2003.

[2] 胡江.阿特拉津降解菌株BTAH1的分离鉴定、降解特性及应用的研究[D].南京：南京农业大学，2004.

[3] 温雪松.阿特拉津降解菌株的分离和鉴定[D].天津：南开大学，2004.

[4] 潘学冬，虞云龙.生物修复中细菌的遗传修饰[J].微生物学报，2002，42(1)：121-124.

[5] 张宏军，等.莠去津微生物降解的研究进展[J].农药学学报，2002(4)：10-16.

[6] 胡宏韬，林学钰，陆雍森.地下水除草剂阿特拉津污染微生物治理的实验研究[J].环境科学，2003，24(6)： 144-147.

[7] 王松文，吕宪禹，江磊，等.假单胞菌AD1菌株对阿特拉津污染土壤的生物修复[J].南开大学学报，2001，34(3)：121-122.

[8] 蔡宝立，黄今勇，石建党，等.阿特拉津降解菌株的分离和鉴定[J].微生物学通报，2001，28(2)：22-26.

[9] 张兰英，林学钰，张慧芳，等.地下水中阿特拉津降解菌种的筛选及其降解实验[J].环境化学，2002，21(5)：490-494.

[10] 胡江，代先祝，李顺鹏.阿特拉津降解菌BTAH1的分离与鉴定[J].中国环境科学，2004，24(6)：738-742.

[11] Topp E, Hong Zhu, Nour S, et al. Characterization of an Atrazine- Degrading Pseudaminobacter sp. Isolated From Canadian and French Agricultural Soils[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 2773-2782.

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[13] Sajjaphan K, Shapir N, Judd AK et al. Novel psbA1 gene from a naturally occurring Atrazine-resistant cyanobacterial isolate[J]. Appl Envrion Microbiol, 2002, 68(3): 1358-1366.

[14] Smith D, Alvey S and Crowley D E. Cooperative catabolic pathways within an atrazine-degrading enrichment culture isolated from soil[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2005, 53(2): 265-273.

[15] 王秀国，朱鲁生，王军，等.细菌HB-5对除草剂莠去津的酶促降解研究[J].环境科学学报，2006，26(4)：579-583.

Isolation and Identification of Atrazine High Efficient Degradation Bacteria

LYU Huiping
(Department of Chemical Engineering, Heze College, Heze 274015, China)

3 atrazine degradation bacterium strains were isolated from the farmland and orchard soil of long-term use of atrazine, and marked as AT-2, AT-3 and AT-4. AT-2 and 3 strains of this laboratory existing degradation bacteria HB-1, HB-7 and HW-4, were preliminary identif ed by physiological and biochemical indexes and morphological analysis, and they were soil bacillus genus brucella, staphylococcus, pseudomonas, respectively. Bacteria degradation rate of the four strains was determined. The reaction conditions were: the substrate concentration of atrazine was 100 mg/L, reaction system 5 mL, 5% of inoculation quantity, constant temperature 30℃, 180r/min, cultivate 24h, the degradation eff ciency were 34.2%, 37.3%, 43% and 34.2%, respectively. After 3d, degradation rate of 4 isolates could reach about 90%.

atrazine; degradation bacteria; degradation rate

TQ 457.2

A

1671-9905(2017)02-0022-03

吕惠萍(1985-)，女，菏泽学院化学化工系助理实验师。研究方向：应用化学

2016-12-13