河北省不同地区杠柳遗传多样性的ISSR分析

狄魁颖++黄大庄++贾艳晶++张显国++王伟++霍腾达

摘要：通过ISSR分子标记技术，对采自河北石家庄、保定、邢台、邯郸、张家口的11个杠柳（Periploca sepium Bunge）样品进行遗传多样性分析。结果表明，从100条通用引物中共筛选出34条适用于杠柳ISSR研究的多态性引物；对11个供试样品进行PCR检测，进一步筛选出8条多态性好、稳定性高的引物，共检测出79个ISSR位点，多态性位点63个，占79.7%；遗传相似系数（GS）变化范围在0.454 5～0.854 5，8对多态性引物多态信息含量值变化范围为0.747～0.884，平均为0.827；11份供试样品聚类分为三大类，聚类相对复杂，呈一定的地域相关性；ISSR分子标记适用于杠柳遗传多样性研究，且杠柳遗传多样性丰富。

关键词：杠柳（Periploca sepium Bunge）；ISSR；分子标记；遗传多样性

中图分类号：S326；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0570-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.046

Genetic Diversity Analysis of Periploca sepium Bunge in Hebei Province by ISSR Markers

DI Kui-ying1，HUANG Da-zhuang1，JIA Yan-jing1，ZHANG Xian-guo2，WANG Wei3，HUO Teng-da4

（1. College of Landscape and Travel，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Highway Administration Bureau of Hebei Province， Shijiazhuang 050000，China；3. Great Wall Motor Co.， Ltd.， Baoding 071000，Hebei，China；4. Luanping County Propaganda Department，Chengde 068250， Hebei，China）

Abstract：ISSR makers was used to analyze the genetic diversity of 11 Periploca sepium Bunge samples from Shijiazhuang， Handan， Xingtai， Zhangjiakou， Baoding. The results showed that 34 polymorphic primers were selected from 100 general primers for ISSR analysis. 11 samples were tested for PCR， and 8 primers with good polymorphism and stability were screened out， 79 ISSR loci were amplified by 8 primers， among which 63 loci were polymorphic， accounting for 79.7%. Genetic similarity coefficient varied in the range of 0.454 5～0.854 5. the change range of PIC values of polymorphic primers was 0.747～0.884， the average was 0.827. 11 samples were clustered into 3 groups， and the cluster was relatively complex， the accessions were significantly related to the geographical. ISSR molecular markers were applied to the study of genetic diversity of Periploca sepium Bunge， and the genetic diversity was rich.

Key words：Periploca sepium Bunge； ISSR； molecular markers； genetic diversity

杠柳（Periploca sepium Bunge）又叫北五加皮、桃枝子、羊奶子、羊角桃等，是蘿藦科杠柳属植物。在河北全省均有分布，主要集中于太行山山区，道路两旁以及田间荒坡，其根皮为传统中药材，有祛风湿、利水消肿、强筋骨的作用[1]，其特性为喜光、耐寒、耐旱、耐荫、耐盐碱。根系分布深，呈丛生状态[2]。杠柳具有广泛的适应性，是优良的固沙、水土保持树种，不仅是优良的高速公路边坡绿化树种，同时也是煤矸石山生态恢复的可自然定居树种[3]。近年来，随着杠柳药理作用不断被开发，市场需求增加，出现过度采挖，而其种苗繁育迟缓，不利于进一步开展资源保护利用以及人工培植规划[4]。目前，国内外对杠柳研究多集中于生理生态及药理生态的研究，DNA分子水平研究鲜见报道。本研究利用ISSR分子标记方法对11个不同地区杠柳进行分析，筛选适用于杠柳ISSR分子标记的引物，并分析其遗传多样性，旨在为后续应用分子标记方法对杠柳进行相关研究以及杠柳种质资源的合理开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试的11份杠柳种质资源，分别采自保定、石家庄、邯郸、张家口、邢台等地（表1），选择当年萌发的新鲜叶片，低温下洗净、晾干，-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 杠柳基因组DNA的提取

采用改良CTAB法提取供试样品DNA：取新鲜叶片1 g，加入适量液氮置于预冷的研钵中快速研磨，待叶片研磨成粉末，快速装入预冷的2 mL离心管中，加入提前预热的DNA提取液750 μL，充分振荡混匀。将混匀后的离心管64.5 ℃热水浴30 min，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，重复此步骤两次。取上清液，加入等体积的预冷异丙醇放入-20 ℃冰箱中冻沉3 h。冻沉结束后，弃上清液，保留管底白色物质，70%乙醇清洗2次，无水乙醇清洗1次，放入烘箱烘干，加入50 μL ddH2O和1 μL RNA酶，冷却至室温，放入4 ℃冰箱保存备用。

用NANODROP2000型超微量核酸仪检测浓度和纯度，质量浓度稀释至50 ng/μL，4 ℃保存用于ISSR分析。

1.3 引物筛选

扩增引物按照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR引物序列，由上海生物工程股份有限公司合成。随机选取8个地区供试样品进行ISSR引物的筛选，从中筛选出适用于杠柳ISSR研究的多态性引物，并进一步筛选多态性好、背景清晰、稳定性高的高效率引物。每个引物扩增程序重复2次，每条引物的变性温度根据引物的Tm值设置12个梯度进行筛选[5]。具体引物序列以及退火温度见表2。

1.4 ISSR-PCR扩增与产物检测

1.4 1PCR扩增反应体系 ISSR-PCR扩增在BIO-RAD 公司生产BS97MyCycler型PCR仪上进行。ISSR反应体系：25 μL反应体系中含有12.5 μL的 Taq Master Mix，正向引物和反向引物各10 μL，50 ng模板DNA。

1.4.2 扩增反应程序 ISSR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，52～62 ℃（每条引物不同，详见表2）退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共40个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min，扩增产物4 ℃保存。

1.4.3 扩增产物检测 在1×TAE缓冲系统下，取10 μL扩增产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上电泳分离，用DL2000 Marker作为标准分子量进行对照，稳定电压170 V，经溴化乙锭（EB）染色后在凝胶成像仪上观察并照相记录。

1.5 数据统计与分析

根据ISSR扩增产物条带在琼脂糖凝胶上的迁移率，对扩增条带进行二元数据统计，有条带的赋值为“1”，无条带的赋值為“0”，条带弱的位点在重复扩增中稳定出现的记为“1”，建立“0”“1”原始数据矩阵。用NTSYS-pc 2.10e软件进行相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物在杠柳上的通用性分析

以供试材料基因组DNA为模板，对100条ISSR通用引物进行筛选，扩增结果表明，43条能扩增出产物，其中9条无多态性，其余均呈现多态性（表2），通用性较低。图1所示为引物UBC826扩增图谱。34条多态性引物扩增共得到236条DNA条带，其中多态性条带194条，多态率82.2%。每对引物扩增条带数量范围在2～16条，平均为6.94条。扩增条带最多的是UBC895，达16条，多态率也达最高为100%，扩增条带较少的引物仅得到2条，如UBC817、UBC824、UBC840、UBC846、UBC853，但多态率均达100%，其中引物UBC866仅得到2条DNA条带，并且多态率最低为50%。扩增DNA片段大小在100～2 000 bp，以500～1 000 bp居多。以上数据表明，ISSR分子标记检测杠柳遗传多样性效率较高，同时说明杠柳种质资源具有丰富的遗传多样性。

2.2 高效率ISSR引物筛选

对11份供试样品进行ISSR-PCR扩增并检测，进一步筛选出8条背景清晰、多态性好、稳定性高的引物进行后续遗传多样性研究（表3）。8对引物共得到79条条带，多态性条带63条，多态率达79.7%。以此可见，杠柳种质资源在分子水平上多态性丰富；扩增片段长度在100～2 000 bp之间，每条引物平均扩增条带9.88条，PIC变幅为0.747～0.884，平均为0.827，说明8对引物均为高度多态性信息引物[6]，图2为引物UBC818扩增图谱。

2.3 亲缘关系分析

利用NTSYS-pc 2.10e软件计算供试材料间的遗传相似系数，得到相似性矩阵（表4）。遗传相似系数（GS）可以揭示不同地区种质间彼此遗传关系远近，11个不同地区供试样品遗传相似系数变化范围在0.454 5～0.854 5，其中供试样品6与9亲缘关系最近，遗传相似性系数高达0.854 5，供试样品6与10亲缘关系最远，遗传相似性系数仅为0.454 5。结果表明，不同地区杠柳种质资源遗传差异明显。

2.4 聚类分析

利用NTSYS-pc 2.10e软件对11份杠柳供试样品进行UPGMA聚类分析，通过Tree plot模块生成聚类分析树状图（图3）。从图3可以看出，11个不同地区种质材料在相似系数为0.60水平上分为三大类，第Ⅰ类为来自石家庄赞皇、邢台内丘、沙河、邯郸涉县和武安的样品；在相似系数为0.70水平上，第Ⅰ类样品中来自邯郸涉县的样品与邢台内丘和石家庄的样品区别开来。第Ⅱ类共包括5份种质，分别来自于保定易县、满城、阜平、涞水、涞源。来自张家口的样品作为单独一支，为第Ⅲ类。由此可见，杠柳种质亲缘关系与地理分布呈一定相关性，其生长区域越近亲缘关系越近，充分体现了地域分布和环境对杠柳的影响。

3 小结与讨论

物种的遗传多样性反映该物种适应环境的能力，遗传多样性越丰富，在不同生境存活的可能性越大[7]。ISSR分子标记具有较高的多态性和稳定性，无需预知物种DNA信息背景，操作简单，广泛应用于植物的遗传多样性研究[8]。本研究通过筛选得到8对高效ISSR引物，对11份地理来源不同的杠柳种质进行遗传多样性分析，共检测到位点79个，多态率达79.7%，多态性较高，表明供试杠柳基因组DNA具有明显的遗传差异，多样性丰富。ISSR分子标记是一种有效的用于杠柳种质资源遗传多样性研究的技术。尹海波等[9]利用ISSR技术对老鹳草遗传多样性进行分析，其多态率高达94.6%，赵雪英等[10]利用ISSR标记探讨了33份绿豆种质资源的遗传多样性，多态率达98.18%。虽然本研究中引物多态率达到79.7%，但仍低于上述两个研究，分析原因可能是物种的差异导致多态率的差异，多态性引物需要进一步筛选。

本研究对杠柳遗传多样性仅采用了ISSR技术，但高山等[11]利用RAPD和ISSR两种分子标记对苦瓜种质资源的遗传多样性进行检测，发现2种分子标记方法都能检测其较高的遗传多样性，ISSR标记较RAPD标记多态性更高。王志清等[12]利用ISSR和SRAP标记分别对61份细辛资源进行遗传多样性分析，结果表明相同数量的引物，ISSR标记揭示的多态性高于SRAP标记。王惠梅等[13]分别应用SSR和ISSR对野生菰资源遗传多样性进行分析表明，SSR标记多态性比率较ISSR要高。因此，在以后的研究应进一步采用其他标记技术，筛选更适合杠柳的分子标记技术。

分子标记是研究物种遗传多样性的基础工作之一，因研究材料和技术不同，研究结果不尽相同。本研究结果表明，不同地区杠柳的亲缘关系与地域分布呈一定相关性，这与胡仲义等[14]对麦冬种质资源ISSR分析研究结果一致。任风鸣等[15]对金钱草种质的ISSR研究结果表明，通过ISSR標记的亲缘关系聚类与地理分布不具有明显的相关性。

从聚类分析可以看到，一方面，供试材料在聚类中按照纬度变化呈一定的地域相关性，反映地域隔离产生遗传差异；另一方面，来自保定不同县域的种质也产生了遗传差异，充分体现表明杠柳多样性丰富，进一步开发利用的空间较大。为更全面和真实地揭示杠柳的遗传多样性，更为合理利用、保护和管理杠柳种质资源，有必要采用多种技术手段、对更大范围内杠柳种质进行研究和检测其遗传多样性。

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