Notch1及P16在软骨肉瘤中的表达及临床意义

王克猛 魏世平

·论著·

Notch1及P16在软骨肉瘤中的表达及临床意义

王克猛 魏世平

目的 观察软骨肉瘤中Notch1蛋白及P16蛋白的表达情况，探讨其在软骨肉瘤发生发展中的作用机制。方法 选取软骨肉瘤46例，骨软骨瘤18例及正常骨组织10例。以SP法检测组织中Notch1及P16蛋白表达的情况。结果 Notch蛋白阳性表达为细胞膜和细胞浆内有棕黄色颗粒。在骨软骨瘤及软骨肉瘤中Notch1的阳性表达率明显高于正常软骨组织(P<0.05)，软骨肉瘤中Notch1的阳性表达率明显高于骨软骨瘤(P<0.05)。Notch1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 不同组织学分级的软骨肉瘤中的阳性表达率随分化程度降低逐渐增高(P<0.05)。P16蛋白阳性表达为细胞核或/和细胞浆内有棕黄色颗粒出现。P16蛋白在正常软骨组织及骨软骨瘤中的均为阳性表达，在软骨肉瘤中阳性表达率为39.1%(18/46)。软骨肉瘤组织中P16蛋白阳性表达率明显低于其他两种组织(P<0.05)。不同组织学分级软骨肉瘤中P16蛋白的阳性表达率分别为68.8%(11/16)、30%(6/20)和20%(1/10)，阳性表达率随分化程度越低而降低(P<0.05)。Notch1及P16蛋白的表达情况与患者的性别、年龄、体积大小及肿瘤发生部位均无统计学意义(P>0.05)。结论Notch1蛋白高表达、P16蛋白低表达可能协同促进软骨肉瘤的恶性细胞的增殖能力，在肿瘤的发生及发展起着重要的作用，为进一步的研究和临床治疗提供病理学依据。

Notch1蛋白；P16蛋白；软骨肉瘤；免疫组织化学

软骨肉瘤(chondrosarcoma，CHS)是一类起源于间质细胞具有多分化潜能的恶性骨肿瘤，起源于软骨组织的恶性肿瘤，以产生软骨基质为特征[1,2]。Evans等[3]根据软骨肉瘤的恶性程度将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级三类，即恶性程度为低、中、高。软骨肉瘤细胞对放疗、化疗等手段都不太敏感，在手术切除后非常复发和转移，预后较差[4]。本研究通过免疫组织化学SP 法研究Notch及P16蛋白在软骨肉瘤中表达情况，探讨其临床意义，以期为软骨肉瘤的分子靶向治疗提供新的标记物，改善患者预后。软骨肉瘤的分子靶向治疗具有特异性高、损伤小、毒副作用小的特点，已成为继手术、放疗和化疗之后的新的治疗手段。因此，寻找可用于治疗软骨肉瘤的靶点对于软骨肉瘤的治疗具有十分重要的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取邢台医专第一附属医院病理科2008年3月至2014年3月期间手术切除经病理明确诊断为软骨肉瘤的存档病例，复习原切片及免疫组织化学资料，根据2002年WHO软组织与骨肿瘤病理学和遗传学分类标准[5]，经两位资深骨病理医师阅片确定，筛选出普通型软骨肉瘤46例，其中男25例，女21例；患者年龄5～83岁，中位年龄43.7岁；发生部位：股骨27例，髋骨(髂骨、耻骨、坐骨)11例，其他部位8例；组织学分级Ⅰ级16例、Ⅱ级20例、Ⅲ级10例；所有患者为散发病例，且为初次手术，术前均未经放射治疗或化疗。另外选取骨软骨瘤18例及正常软骨组织10例作为对照。

1.2 方法 所有标本经10%中性缓冲甲醛固定，常规取材、脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片，连续切片，贴于涂有APES的载玻片，用SP法进行免疫组织化学法染色。兔抗人Notch1多克隆抗体试剂盒、鼠抗人P16单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司，免疫组化染色按试剂盒操作说明进行，染色过程中设阳性和阴性对照，阳性对照用已知阳性切片，阴性对照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫组化染色结果判断标准 (1)Notch1蛋白阳性表达主要定位于细胞膜和细胞浆上，表现为细胞膜和细胞浆内有棕黄色颗粒出现。显微镜下盲法阅片，400×高倍镜下随机观察10个视野(向同一方向移动切片，不重复，不重叠)，每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数。免疫组织化学染色结果按照文献采用以下判断标准。以各视野中阳性细胞的平均百分数进行计分。0～5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。(2)染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分。细胞未着色为0分，染色呈淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最后以阳性细胞的百分比和染色强度计分之和所得总分进行结果判定。0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)， 4～5分以上为强阳性(++)[6]。(3)P16蛋白免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色和(或)棕褐色颗粒，阳性表达定位于细胞核或(和)细胞浆上，400×高倍镜下随机观察10个视野(向同一方向移动切片，不重复，不重叠)，每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，观察阳性细胞与细胞总数的比例关系。无阳性细胞为阴性(-)；表达≤50%为阳性(+)；>51%为强阳性(++)[7]。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件,计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Notch1蛋白免疫组化表达情况Notch蛋白阳性表达特征为细胞膜和细胞浆内有棕黄色颗粒。在骨软骨瘤及软骨肉瘤中Notch1的阳性表达率明显高于正常软骨组织(P<0.05)，软骨肉瘤中Notch1的阳性表达率明显高于骨软骨瘤(P<0.05)。Notch1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 不同组织学分级的软骨肉瘤中的阳性表达率随分化程度降低逐渐增高(P<0.05)。见图1，表1、2。

图1 Notch1在骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达HE (IHC×400)

表1 Notch1在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达 例

注：与正常软骨组织比较,*P<0.05；与骨软骨瘤比较，#P<0.05

表2 Notch1在不同分化程度的软骨肉瘤中的表达 例

注：与Ⅰ级比较，*P<0.05；与Ⅱ级比较，#P<0.05

2.2P16蛋白免疫组化表达情况P16蛋白阳性表达为细胞核或(和)细胞浆内有棕黄色颗粒出现。本实验中P16蛋白在正常软骨组织及骨软骨瘤中的均为阳性表达情，在软骨肉瘤中阳性表达率为39.1%(18/46)。软骨肉瘤组织中P16蛋白阳性表达率明显低于其他两种组织(P<0.05)。不同组织学分级软骨肉瘤中P16蛋白的阳性表达率分别为68.8%(11/16)、30%(6/20)和20%(1/10)，阳性表达率随分化程度越低而降低(P<0.05)。见图2，表3、4。

2.3Notch1及P16蛋白与软骨肉瘤主要临床病理资料间的关系Notch1及P16蛋白的表达情况与患者的性别、年龄、体积大小及肿瘤发生部位均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

3 讨论

Notch信号是一个进化中高度保守的跨膜受体信号通路家族，其所编码的单链跨膜受体蛋白，其所编码的单链跨膜受体蛋白在细胞的分化、个体发育的中起着关键作用，从无脊椎动物到脊椎动物等多种物种的细胞中均有表达，广泛分布和表达在多种组织中。其家族成员重要作用之一是调控细胞的发育和凋亡，以及调节胚胎发育、成人器官的干细胞，也可以被恶性肿瘤激活[8]。目前，在脊椎动物中发现了Notch1、Notch2、Notch3和Notch4同源体，其中Notch1蛋白是主要的受体[9]。Notch1信号通路主要作用于细胞的分化发育、增殖凋亡等，而且某些肿瘤的发生和发展也与Notch1信号通路密切相关。

图2 P16在骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达HE (IHC×400)

表3 P16在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达 例

注：与软骨肉瘤比较,*P<0.05

表4 P16在不同分化程度的软骨肉瘤中的表达 例

注：与Ⅰ级比较，*P<0.05；与Ⅱ级比较，#P<0.05

表5 CDK4、P16的表达与临床病理特征的关系 例

Notch1信号蛋白编码一种膜蛋白受体，通过诱导细胞凋亡、增殖和分化多效性作用的信号途径调节多细胞动物的形态发育和形成。“三步蛋白质水解模式”是Notch信号传导通路中重要的分子事件，当其配体与受体结合后诱导受体蛋白水解，Notch蛋白从膜上释放的活化形式为NICD，NICD进入核内后，其RAM区以及CSL蛋白、MAml蛋白结合后形成转录复合物，与下游su(H)/CBF1家族转录因子结合，激活相关转录因子，上调它们的活性，在细胞分化的起始过程中发挥着精确调控作用。

P16基因定位于9p21，是一种抑癌基因，定位于9p21。P16的转录产物由外显子1a、2、和3构成，编码P16(INK4A)蛋白，它与P15(INK4B)、P18(INK4C)及P19(ARF)共同组成INK4(细胞周期依赖性激酶抑制剂)家族，在正常细胞生长调控中起着至关重要的作用，与细胞分化及预后有关。P16作为细胞周期素依赖性激酶抑制剂，它在细胞周期的许多调节环节处起到一个闸的作用，P16蛋白与CyclinD竞争性特异性结合细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4及其相关激酶CDK6相互作用，抑制Rb磷酸化，在Gl期(DNA合成前期)阻止细胞分裂，从而抑制细胞周期从G1进入S期，对细胞增殖周期起负性调节作用[10]。当P16基因出现异常改变、缺失或突变以及功能丧失时，它可抑制CyclinD-CDK4的活性，使细胞周期加速，DNA在还没修复前就迅速从G1期进入S、G2、M期，细胞过度增殖从而导致细胞失控性生长和肿瘤的形成[11]。

Notch1蛋白可以使许多实体瘤及血液系统肿瘤异常表达，促使正常细胞向恶性转化，已经在很多实验证实。在乳腺癌中低分化、分期晚、淋巴结转移以及脑转移相关[12]都与Notch1蛋白的高表达密切相关。Notch蛋白信号通路过表达可能参与胃黏膜的癌变过程[13]，Notch1蛋白在胃癌中表达明显高于正常胃组织，李大卫等[14]研究发现，Notch1蛋白的高表达并与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、脉管浸润程度密切相关。在食管癌、舌癌、结直肠癌、宫颈癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞中Notch1蛋白都呈高表达[15-17]。Notch1蛋白并不是一个独立的预后因素，其作用与肿瘤及其他信号通路的影响有密切联系[18]，在不同的肿瘤微环境中，可能会促进或抑制肿瘤发生发展。非浸润性膀胱癌中的患者的预后不良与Notch1的低表达密切相关[19]。在食管鳞癌中则可能是一种抑癌基因[20]。在食管癌、胃肠癌、肺癌、妊娠滋养细胞瘤、鼻咽癌、神经胶质细胞瘤等多种恶性肿瘤中P16基因异常表达，P16蛋白的失活，与恶性肿瘤细胞的发生发展中起重要作用[21-25]。

该研究结果显示，Notch1蛋白的阳性表达率在软骨肉瘤、骨软骨瘤及正常软骨组织3组间逐渐增高，组间差异性有统计学意义(P<0.05)。软骨肉瘤中Notch1蛋白阳性表达与病理组织学分级密切相关，软骨肉瘤分级的升高，Notch1的阳性表达率越高，提示其增高可能促进软骨肉瘤的恶性增殖能力提高。P16蛋白在本实验正常软骨组织及骨软骨瘤标本均是阳性表达，而在软骨肉瘤中的阳性表达率为39.1%，且分化程度越低P16蛋白阳性表达率也随之降低(P<0.05)。提示P16蛋白失活、Notch1过表达与软骨肉瘤的发生有密切关联，使细胞获得无限增殖能力，向恶变发展，为软骨肉瘤进一步的研究和临床治疗提供病理学依据。

1ChowWA.Updateonchondrosareomas.CurrOpinOncol,2007,19:371-376．

2RozemanLB,HogendoomPC,BoveeJV.Diagnosisandprognosisofchondrosarcomaofbone.ExpertRevMolDiagn,2002,2:461-472.

3EvansHL,AyalaAG,RomsdahlMM.Prognosticfactorsinchondrosareomaofbone:aclinicopathologicanalysiswithemphasisonhistologicgrading.Cancer,1977,40:818-831.

4SakimuraR,TanakaK,YamamotoS,etal.Theeffectsofhistonedeacetylaseinhibitorsontheinductionofdifferentiationinchondrosarcomacells.ClinCancerRes,2007,13:275-282.

5LeethanakulC,PatelV,GillespieJ,etal.Distinctpatternofexpressionofdifferentiationandgrowth-relatedgenesinsquamouscellcarcinomasoftheheadandneckrevealedbytheuseoflasercapturemicrodissectionandcDNAarrays.Oncogene,2000,19:3220-3224.

6 姜昕,周建华.邓征浩非小细胞肺癌中Notch1、HIF-1、VEGF蛋白及Notch1mRNA的表达及意义.临床与实验病理学杂志,2008,7,24:276-279.

7 郭成学.P16蛋白与软骨肉瘤临床病理特征及预后关系.中原医刊,2006,9,33:84-85.

8IzrailitJ,ReediikM.Developmentalpathwaysinbreastcancerandbreasttumor-initiatingcells:therapeuticimplications.CancerLett,2012,317:115-126.

9MaD,DongX,ZangS,etal.AberrantexpressionandclinicalcorrelationofNotchsignalingmoleculesinbreastcancerofChinesepopulation.AsiaPacJClinOncol,2011,7:385-391.

10ZavoralM,MinarikovaP,ZavadaF,etal.Molecularbiologyofpancreaticcancer.WorldJGastroenterol,2011,17:2897-2908.

11LiJ,PoiMJ,TsaiMD.RegulatorymechanismsoftumorsuppressorP16(INK4A)andtheirrelevancetocancer.Biochemistry,2011,50:5566-5582.

12IzrailitJ,BermanHK,DattiA,etal.HighthroughputkinaseinhibitorscreensrevealTRB3andMAPK-ERK/TGFpathwaysasfundamentalNotchregulatorsinbreastcancer.ProcNatlAcadSci,2013,110:1714-1719.

13 杨晓东,张辉,白志刚.Notch信号通路在胃癌组织中的表达及其意义,中华普通外科杂志,2009,24:146-148.

14 李大卫,吴晴,彭志海,等.组织芯片研究Notch1与NF-κB在胃癌中的表达和意义.肿瘤,2007,27:458-461.

15SriuranpongV,BorgesMW,RaviRKetal.Notchsignalinginducescellcyclearrestinsmallcelllungcancercells.CancerRes,2001,61:3200-3205.

16TaloraC,CialfiS,SegattoO,etal.ConstitutivelyactiveNotch1inducesgrowtharrestofHPV-positivecervicalcancercellsviaseparatesignalingpathways.ExpCellRes,2005,305:343-354.

17 李钰泉,周天骏,张惠忠.Notch1和Notch3在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义.中华实验外科杂志,2013,30:2714-2716.

18LiY,BumsJA,CheneyCA,etal.DistinctexpressionprofilesofNotch1proteininhumansolidtumors:Implicationsfordevelopmentoftargetedtherapeuticmonoclonalantibodies.Biologies,2010,4:163-171.

19 史涛坪,马鑫.付斌.Notch信号通路基因在膀胱癌中的表达及其与预后的关系.中华实验外科杂志,2010,27：1305-1307.

20 鲁照明,刘红涛,许培荣,等.Notch1信号途径在食管鳞癌细胞株EC9706的作用研究.中国肿瘤临床,2007,34:740-743.

21 陈新,平育敏,白世祥,等.P16和p53在食管鳞状细胞癌中的表达及意义.实用肿瘤杂志,2004,19:23-27.

22 卢艳丽,范伟.癌基因c-myc和抑癌基因P16在大肠癌中的表达.中国误诊学杂志,2004,4:1383-1385.

23 王庆国,王峰,刘晶,等.p16蛋白在胃癌组织中的异常表达及其意义.吉林大学学报(医学版),2005,31:921-923.

24 冯蓓,杨卫卫,杨小平,等.p16基因在不同非小细胞肺癌之间的表达比较.陕西医学杂志,2015,40:618-620.

25 刘嗣超,邬晋芳.Survivin、MMP-2及p16蛋白在卵巢上皮癌中的表达及临床意义.陕西医学杂志,2015,44:497-499.

Expression and clinical significance of Notch1 and P16 in chondrosarcoma

WANGKemeng*,WEIShiping.

*DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

Objective To observe the expressions of Notch1 protein and P16 protein in chondrosarcoma in order to explore their action mechanism in the pathogenesis and and development of chondrosarcoma.Methods The expression levels of Notch1 protein and P16 protein were detected by immunohistochemistry (SP) in 46 cases of chondrosarcoma,18 cases of osteochondroma and 10 cases of normal cartilage tissues.Results The positive expression rate of Notch1 protein in osteochondroma and chondrosarcoma was significantly higher than that in normal cartilage tissues (P<0.05),moreover,thepositiveexpressionratesofNotch1proteininchondrosarcomawassignificantlyhigherthanthatinosteochondroma(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofNotch1proteinwasgraduallyincreasedindifferenthistologicalgradesofchondrosarcoma(gradeⅠ,gradeⅡ,gradeⅢ),withthedecreaseofdifferentiationdegree(P<0.05).ThepositiveexpressionsofP16proteinwereobservedinnormalcartilagetissuesandinosteochondromatissues.ThepositiveexpressionrateofP16proteininchondrosarcomawas39.1% (18/46),whichwassignificantlylowerthanthatinosteochondromatissuesandinnormalcartilagetissues(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofP16proteinindifferenthistologicalgradesofchondrosarcoma(gradeⅠ,gradeⅡ,gradeⅢ)was68.8% (11/16),30% (6/20),20% (1/10),respectively,whichwasgraduallydecreasedwiththedecreaseofdifferentiationdegree(P<0.05).TheexpressionsofNotch1proteinandP16proteinwerenotcorrelatedtopatient’sage,sex,tumorsize,tumorposition(P>0.05). Conclusion The high-expression of Notch1 protein and low-expression of P16 protein may synergistically promote the proliferation ability of chondrosarcomatous malignant cells,which may play an important role in the pathogenesis and development of chondrosarcoma,and the research results provide pathological basis for clinical treatment and further research.

Notch1 protein; P16 protein; chondrosarcoma; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.005

054000 河北省邢台市，邢台医学高等专科学校第一附属医院骨科(王克猛)；邢台医学高等专科学校(魏世平)

魏世平,054000 河北省邢台市，邢台医学高等专科学校；

E-mail:weishiping2003@163.com

R

A

1002-7386(2017)06-0822-04

2016-10-11)