ELISpot检测技术操作要求及质量控制

刘佳/辽宁省大连市畜牧总站

ELISpot检测技术操作要求及质量控制

刘佳/辽宁省大连市畜牧总站

酶联免疫斑点检测技术( enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA)基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。

一、细胞质量控制

1.采血。选取45～50日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。

2.淋巴细胞分离。6 h内进行外周血单个核细胞(PBMC)的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000转/分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。吸出中间环状乳白色PBMC富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。

3.计数。用血球计数板计数，注意加细胞悬液时要干净利落，加量适中，过多容易使盖玻片漂移或淹过盖玻片，过少容易出现气泡。细胞悬液混合不均匀直接影响计数的准确性。镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，需重新将细胞悬液进行混合，再进行计数。

4.细胞冻存与复苏。

细胞冻存：可以选择对细胞无毒性、溶解度大、容易穿透的保护剂，比如二甲亚砜、甘油等。若不添加保护剂直接冻存，会导致胞内和外环境中的水形成冰晶，细胞内发生机械损伤引起细胞死亡。降温的顺序应从室温→4℃（20 min〕→冰箱冷冻室（30 min）→低温冰箱（-30℃/1 h）→气态氮（30 min）→液氮，使用液氮时避免低温冻伤。

细胞复苏：取细胞时要戴防低温手套、护目镜，取出细胞将其放入37℃水浴快速摇晃，使细胞完全复苏，此步骤动作要迅速，使细胞避免经过容易受损的0℃，复苏后要对细胞重新进行计数，活细胞数过低会对检测结果造成影响。

二、刺激物质量控制

1.特异性刺激物。特异性刺激物通常包括病毒、疫苗毒、T细胞表位多肽等，可以根据检测目的不同来选择。在提取疫苗毒可通过反复冻融、超声波、加化学物质等方法来提取。

2.非特异性刺激物。ELISpot检测中最常用的是将植物血球血凝素（PHA）或有丝分裂原ConA作为非特异性刺激物，刺激物浓度的选择尤为重要，浓度过高时，斑点连片不清晰，背景颜色略深；浓度过低时，斑点数量较少，均达不到对照的效果。通常情况下，PHA的斑点数100左右为佳。

三、操作质量控制

1.加样。使用移液器时，保证垂直、悬空加样，速度要慢，避免液体溅出，排液时速度要快，注意管壁不要残留液体或者由于排液过慢导致回吸而产生气泡，使用排枪时，注意液面要齐。加液时不能用力触碰板低，操作不当会损坏PVDF膜，影响结果判定。

2.孵育。CO2的浓度、湿度、抗体浓度、作用时间都会造成背景和敏感性差异。ELISpot检查技术常用的孵育温度是 37℃，温度不宜过高，孵育过程中，反应温度要均匀，使所有的反应样品尽可能达到平衡，不要将反应板叠加放到CO2培养箱内，受热不均会导致部分细胞无法得到充分刺激。由于孵育时间较长，为避免液体蒸发，反应板放入培养箱之前应贴上封板膜或盖好盖子，也可放入湿盒，培养期间定期观察CO2浓度情况。

3.试剂。试剂现用现配，分装成管，反复冻融会造成试剂（抗体或重组细胞因子）失活，因此，配好的试剂尽量在保质期内使用。试剂的用量要不断的优化，要与细胞的数量成相应的比例，检测不同的细胞因子应加入合适的细胞量，因为CK分泌细胞分泌不同细胞因子的量是不同的，如果细胞浓度过大，大量分泌的细胞因子将融合形成斑点，从而造成技术误差。

4.显色。对显色反应温度和时间的把控，是试验数据有效、精准的必要条件，显色时间过长会导致背景加深，过短会使显色不完全。读板时，PDFV膜在湿润的情况下仪器无法读取斑点数，所以在底物洗去后应将板倒置自然控干，避免液体回流到板底。特异性斑点呈边缘模糊，有晕，形状圆而规则。

四、结语

总之，随着ELISpot技术的不断发展，此技术在动物疫病诊断的领域也将更加广泛深入，近几年利用ELISpot技术对猪蓝耳病、口蹄疫的研究层出不穷，ELISpot技术即将成为基础实验室及兽医诊断实验室的标准技术。试剂质量、细胞质量、人员操作、主观判定等都是影响此项检测技术结果准确与否的主要因素。正确的实验方法和操作细节对ELISpot在兽医领域的研究和诊断意义重大。

（略）