建立牛奶中黄曲霉毒素M1含量的超高效液相快速测定法

王安波 孙 思 杨 梅 汪 俭 刘文锋

(黔东南州农产品质量安全检测中心，贵州凯里 556000)

建立牛奶中黄曲霉毒素M1含量的超高效液相快速测定法

王安波 孙 思 杨 梅 汪 俭 刘文锋*

(黔东南州农产品质量安全检测中心，贵州凯里 556000)

基于GB 5413.37-2010优化建立牛奶中黄曲霉毒素M1的测定方法，在GB 5413.37-2010第二法基础上，以样品直接离心除杂，通过免疫亲和柱净化，经25%乙腈-水溶液洗脱定容，用超高效液相色谱仪测定，采用外标法定量。该方法对黄曲霉毒素M1的线性范围为0.5～16.0μg/L，R2=0.9997，最低检测浓度为0.1μg/L，样品中的回收率在77.7%～88.6%，RSD≤5%。该方法能对牛奶中的黄曲霉毒素M1含量进行定性和定量分析，方法精密度、准确度较高，操作快速、简便，结果满意。

超高效液相色谱仪 黄曲霉毒素M1牛奶

1 前言

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）主要由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生，均为二氢呋喃香豆素衍生物[1]。黄曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，早在20世纪90年代就已经被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物[2]。

根据《GB 2761-2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》我国乳及乳制品中黄曲霉毒素M1最高限量值为0.5 µg/kg[3]。常用检测方法有免疫亲和法、层析液相色谱法、免疫亲和层析液-质联用法、免疫亲和层析荧光分光度法、双流向酶联免疫法等[4]。本研究在GB 5413.37-2010第二法（免疫亲和层析液相色谱法）的基础上，采用直接离心除杂，免疫亲和柱净化后流动相洗脱定容，用超高效液相色谱测定，外标法定量，建立了生鲜乳中黄曲霉毒素M1的快速测定方法。

2 材料与方法

2.1 试验材料、试剂及仪器

2.1.1 样品：牛奶样品购于当地奶牛养殖场。

2.1.2 药品与试剂：黄曲霉毒素M1（AFM1），标准品含量10µg/ml，Pribolab；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱（VICAM AflaTest WB）；Φ11cm中速定性滤纸（新星，中性）；乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2.1.3 仪器与设备：ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱，waters公司；荧光检测器ACQUITY FLR（带13 µl大体积流通池），waters公司；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 um），waters公司；高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超声波清洗器，上海声彦超声波仪器有限公司；固相萃取装置，杭州赛析科技有限公司。

2.2 标准品储备液和工作液配制

标准品储备液：精密移取黄曲霉毒素M1（10µg/ml）1.00 ml置10 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得黄曲霉毒素M1标准储备液（1µg/ml）。

标准品工作液：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（1µg/ ml）1 ml置10 ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为标准工作液（100µg/L）。

2.3 样品提取与净化

将样品放置至室温（23±3 ℃）下称量30 mL试样，置于聚丙烯离心管中，10000 r/min下离心10 min。上清液经中性滤纸过滤收集至少10 ml滤液为备用液。将黄曲霉免疫亲和柱安装于固相萃取装置上，精密量取10.0 ml备用液自然过柱，用2 ml水洗，真空抽干。用2 ml乙腈（25%）-水溶液洗脱，收集洗脱液，过0.22µm有机相微孔滤膜后上机分析。

2.4 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7µm），柱温30℃；流动相为乙腈-水（25：75），等度洗脱，流速0.20 ml/min；进样量2µl，保留时间3.90±0.15min，运行时间12 min；荧光检测器-大体积流通池；激发波长365 nm、发射波长429 nm。根据仪器特性及实际情况，优化了流速及进样量。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

将2.2中标准工作液精密量取相应体积，用流动相乙腈（25%）-水溶液定容至2 ml，配成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 µg/L的系列标准溶液，涡旋混匀，过0.22 µm滤膜，供液相色谱分析。按照外标法计算得到曲线方程，Y=112919X-12833，R2=0.9997。结果如图1所示，黄曲霉毒素M1浓度在0.5～16.0 µg/L之间呈线性关系，满足含量测定要求。

图1 黄曲霉毒素M1标准曲线

3.2 准确度和精密度试验

采用标准添加法，取牛奶空白样品基质30.0 ml各3份，分别添加3个不同浓度的黄曲霉毒素M1标准品，按照2.3项下的方法进行操作，用外标法做添加回收试验.

牛奶空白基质样品在0.1、0.5、2.0 µg/L 3个不同浓度的黄曲霉毒素M1进行添加回收加标试验，回收率在77.7%～88.6%之间，RSD≤5%。参考《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》附录F，本方法允许回收率范围为60%～120%、相对标准偏差≤30%，说明该方法对牛奶中黄曲霉毒素M1含量的测定均有良好的准确度和精密度。

3.3 检出限

根据黄曲霉毒素M1限量要求，对本方法条件进行低浓度试验，当标准品浓度为0.1µg/L时，如图2A所示，信噪比S/N＞3，表明黄曲霉毒素M1的检出限为0.1µg/L；对牛奶进行加标回收试验，当添加浓度为0.1µg/L时，试验结果如图2B所示，其信噪比S/ N＞10，可以确定该方法的最低定量限为0.1µg/L，满足乳及乳制品限量0.5µg/L要求。

图2 0.1μg/kg黄曲霉M1液相色谱图

3.4 样品测定

对所抽的100份牛奶样品进行黄曲霉毒素M1含量检测，检测结果均为未检出。

4 讨论

4.1 前处理方法优化

在配制黄曲霉毒素M1储备液时，GB 5413.37第二法中采用三氯甲烷进行稀释。因考虑到三氯甲烷毒性极高且采购不便，本方法直接选择购买液体标准品，乙腈进行稀释定容，效果良好。

GB 5413.37第二法中采用50 ml滤液过柱，经10 ml水洗后用4 ml乙腈洗脱并氮吹至50～500µl，用水10倍定容。在实际操作过程中，氮吹后剩余量难以精确计量，因此造成实验误差较大，且操作烦琐。本方法采用10 ml滤液过柱，2 ml水洗真空抽干，直接用乙腈（25%）-水溶液洗脱定容，操作简便且利于控制。

4.2 上机检测条件优化

本试验回收率的关键在于黄曲霉免疫亲和柱，因此在每批次试验之前都要进行柱效验证。本试验过程中对比了三种黄曲霉免疫亲和柱，其中两种免疫亲和柱柱效仅为61%～68%，难以满足定量检测要求。而本试验选用的Waters公司黄曲霉免疫亲和柱经多次试验，柱效均在90%以上，RSD≤5%，效果良好。

5 结论

本试验是基于GB 5413.37第二法，以样品直接离心除杂通过免疫亲和柱净化，经25%乙腈-水溶液洗脱定容，用超高效液相色谱仪测定，采用外标法定量。研究表明，该方法能对牛奶中的黄曲霉毒素M1进行定性和定量分析，方法精密度、准确度较高，操作快速、简便，结果满意。

[1] El Khoury A, Atoui A, Yaghi J. Analysis of aflatoxin M1 in milk and yogurt and AFM1 reduction by lactic bacteria used in Lebanese industry [J]. FoodControl,2011,22(10):1695-1699.

[2] Ren Y P, Zhang Y, Shao S L, et al. Simultaneous determination of multi component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, 1143(1-2): 48-64.

[3] GB2761-2011.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量. GB2761-2011.National food safety standard Limit level of mycotoxins in food (in Chinese).

[4] GB 5413.37-2010.食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定. GB 5413.37-2010. National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products.

王安波（1991-），男，助理兽医师，从事农产品质量安全检测工作。

刘文锋（1969-），男，农业推广研究员，从事农产品质量安全检测工作。