基于DNA熔解曲线技术的金银花种质鉴定

陈媞颖+蒋超+袁媛+陈康+周骏辉+赵玉洋+黄璐琦

[摘要] 将高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术应用于金银花种质鉴定中，对已知7对SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）引物进行筛选，通过熔解曲线峰型及T_m差异，确定适合鉴别引物并考察其DNA模板浓度、退火温度及循环数的适宜范围。结合SIMCA-P软件对荧光信号进行处理分析，结果表明利用其中4对引物的熔解曲线可以区分金银花的3个主栽种质，为进一步完善金银花种质鉴定方法提供了依据。

[关键词] 高分辨率熔解曲线；金银花；种质鉴定

[Abstract] To establish a new high resolution melting analytical method for identification of Lonicera japonica germplasm，the screening of 7 pairs of SSR （simple sequence repeats） primers，determining the suitable diagnostic primers by the differences of peak pattern and T_m was conducted. Then into the DNA template concentration，annealing temperature and the suitable range of cycle number were investigated. Combined with SIMCA-P software for data processing analysis，the results show that three main germplasm honeysuckle could be divided by four sets of primers. It provides methodology for improving L. japonica germplasm identification.

[Key words] high resolution melting；Lonicerae Japonicae Flos；germplasm identification

doi：10.4268/cjcmm20162415

药材金银花的基原植物为忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，在长期的栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系[1-2]。近年来，随着金银花价格走高，栽培面积扩大，新兴产区与传统产区间交互引种，致使出现同质异名或异质同名情况，限制了生产发展和种植效益的提高。由于不同种质金银花在植株形态、药材产量与质量等方面均表现出明显差异，因此建立合适的种质资源鉴定方法，对于金银花的种质资源评价、良种选育、规范种子种苗市场以及保障药材品质均有重大意义。利用分子生物学技术进行种质资源分类与鉴定已取得重要进展，本课题组前期通过对金银花栽培种质进行调查与分类，表明7对SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）引物的指纹图谱可作为“分子身份证”区分全国58个金银花种质[3-4]，但该方法需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行检测，操作复杂、耗时长。

为了建立准确、快速、可视化的主栽种质鉴定方法，本研究将高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术应用于金银花种质SSR鉴定中。高分辨率熔解曲線分析是在实时荧光定量PCR基础上发展起来的一项新技术，其通过监测DNA双螺旋随温度升高时解链情况变化，具有简便、快速、高通量、对样本无污染等优点，在中药鉴定中显示出良好的应用前景 [5]。使用HRM技术检测SSR标记，与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分型相比，不需要PCR后续处等步骤，大大降低了检测时间并提高了灵敏度和特异性[6-7]。本研究使用HRM技术检测金银花种质的7对SSR鉴定标记，通过熔解曲线峰型及T_m差异，实现了金银花3个主栽种质的可视化鉴定，为金银花种质的栽培、流通、追溯监管及仲裁提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche公司），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），5810R型低温冷冻离心（Eppendorf公司） ，MM 400型混合型球磨仪（Retsch公司），数显恒温水浴锅（HH-2型，国华电器有限公司），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene公司，型号GBOXHR）。

1.2 试剂

改良 2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液，含有2%CTAB，100 mmol·L^-1Tris-HCl （三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0）、20 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠（pH8.0）、2.5 mol·L^-1氯化钠；无水乙醇、异戊醇、巯基乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司，均为国产分析纯；LC Green Plus（Idaho公司）。

1.3 样品

收集了来自河北、河南、山东等地的8个金银花种质，分别为：一线红、巨花一号、线花一号、四季花、鸡爪花、亚特红蕾、亚特良种、九丰一号，采样量为10～30株。采集样品为忍冬头茬花，包括二白期花蕾、带叶新枝、带花新枝等，单株取样，样品用硅胶干燥后保存于中国中医科学院中药资源中心。

2 方法

2.1 模板DNA提取

取100 mg实验材料，液氮环境下研磨，采用改良CTAB法提取样品总DNA[9]。经琼脂糖凝胶电泳检测后用核酸定量仪检测定DNA浓度，调整DNA终浓度约50 mg·L^-1，作为模板用于PCR扩增。

2.2 PCR扩增与熔解曲线分析

以不同种质的金银花DNA为模板，在Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增及熔解曲线分析。25 μL PCR反应体系，包括10×buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各0.25 μL，LC Green Plus 2 μL，rTaq酶1 μL，DNA模板1 μL及dd H₂O 17.8 μL。PCR反应及熔解曲线程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，X ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35个循环；再延伸72 ℃ 7 min；PCR结束后进行熔解曲线分析：95 ℃ 变性1 min，40 ℃ 1 min形成异源双链DNA，而后升温至70 ℃，最后从70 ℃至97 ℃，期间每个温度点采集15个荧光值。 X ℃表示退火温度依据引物不同而不同，见表1。

2.3 引物筛选

以8个不同种质的金银花DNA为模板，考察SSSR9008219等7对金银花种质鉴定引物HRM分析熔解曲线峰形和T_m差异的影响，筛选出合适的鉴别引物。SSR信息、扩增片段长度，引物序列及PCR反应条件见表1。

2.4 条件优化

分别考察了DNA模板浓度，退火温度以及循环次数对于熔解曲线峰形和T_m的影响，确定可依据峰形和T_m鉴别不同种质金银花的条件并考察重复性。

2.5 数据分析

采用SIMCA-P11.5对熔解曲线荧光信号进行主成分分析，根据分离度筛选引物。

3 结果与分析

3.1 金银花种质HRM鉴定引物的筛选

为获得适用于金银花种质HRM鉴定引物，以8个金银花常见种质的DNA作为模板，利用SSSR9008219等7对金银花种质SSR鉴定引物进行HRM检测，依据其熔解曲线荧光信号进行主成分分析，筛选出分离度好的引物进行进一步研究。

结果表明引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121的熔解曲线，可以区分种质一线红、亚特红蕾、九丰一号和其他金银花种质。

引物SSSR9008219以亚特良种为基线作差异曲线，亚特红蕾82.9 ℃具有单一拐点，九丰一号83.4 ℃具有单一拐点，与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，亚特红蕾与九丰一号均为双峰，T_m分别为（77.71±0.06），（83.52±0.03）℃ 以及（76.78±0.06），（83.51±0.11）℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，九丰一号、亚特红蕾、一线红均表现出较大的分离度，优于HRM差异曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图1。

引物SSR9118060归一化曲线中，一线红具有74.4，75.7，77.6 ℃ 3个拐点，与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，一线红为双峰，T_m分别为（75.17±0.13），（78.64±0.05） ℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，一线红、亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图2。

引物SSR9122370归一化曲线中，九丰一号具有78.5，82，83.9 ℃ 3个拐点，與其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，九丰一号为双峰，T_m分别为（79.26±0.08），（84.86±0.04） ℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化曲线结果，可专属性鉴定这2个种质，见图3。

引物SSR9553121归一化曲线中，亚特红蕾78.6 ℃具有单一拐点，以亚特红蕾为基线作差异曲线，也可见与其他品种曲线具有明显差异；转换为峰形曲线，亚特红蕾为单峰，T_m为（79.43±0.03）℃。使用 SIMCA-P软件对HRM荧光信号进行主成分分析，线花一号、亚特红蕾、九丰一号均表现出较大的分离度，优于归一化熔解曲线结果，可专属性鉴定这3个种质，见图4。

通过归一化曲线和主成分分析2个方法进行分析和对比，可以看出，同种引物相同条件下，金银花不同种质在种质间表现出较大差异，可专属鉴别相应种质，结合筛选所得4个引物，利用种质间差异可以分别鉴别一线红、亚特红蕾、九丰一号3个种质。通过熔解曲线峰形T_m并计算其RSD，考察不同种质种质内差异性，结果表明金银花不同种质内差异较小，高分辨率熔解曲线法可鉴定相应种质，见表2。

3.2 HRM鉴别条件优化结果

3.2.1 DNA模板浓度 随机选取金银花DNA为模板，逐级调整其质量浓度为30，40，50，60 mg·L^-1以SSR9118060为引物，退火温度为52 ℃，在35个循环的条件下进行HRM分析，结果表明其峰形和T_m在30～60 mg·L^-1无明显差异。

3.2.2 循环数筛选 以SSR9118060为引物，退火温度为52 ℃，分别选择30，35，40为循环数，进行HRM分析并对其峰形及T_m进行比较。结果表明，在30个循环条件下，扩增出的曲线难以成形，可能与扩增效率低有关，在35，40个循环下，DNA熔解曲线峰型一致，T_m无明显差异。

3.2.3 退火温度筛选 以SSR9118060为引物，依次调整退火为48，50，52，54 ℃，在35循环下进行扩增，HRM分析并对其峰形及T_m进行比较。结果表明不同的温度下T_m差异介于0～1.43，无明显差异，峰形结果显示，温度在50～54 ℃有较为稳定的区分度。

3.2.4 重复性 为测试操作重复性，取1个金银花DNA样品，分成9份，使用SSR9118060为引物同时进行扩增，分析高分辨率熔解曲线分型结果，峰形一致，计算其峰T_m为（79.26±0.07），（84.86±0.04） ℃；RSD为0.080%，0.050%。将同一个金银花样品分成4份，使用SSR9118060为引物进行扩增，分4次连续进样，分析高分辨率熔解曲线结果，计算其峰T_m为（79.30±0.13），（85.05±0.24） ℃；RSD为0.18%，0.33%。结果表明该方法重复性较高。

4 讨论

一些农家品种如大毛花、小毛花、大鸡爪花、小鸡爪花、四季花、九丰一号、巨花一号等在山东、河南、河北等主产区广泛种植，并经无性系繁育和修剪成形成其他农家品种。种质差异是影响金银花质量和产量的重要因素，由于种质间植物外观形态差异不明显，且性状特征易随着产地变化而改变。本项目组建立了一套含有7个SSR标记及其SSSR9008219等7对引物的金银花种质鉴定标记，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱可区分来自全国各地的58个金银花种质。

在此基础上，本文针对其中亚特红蕾、九丰一号等8个种质，引入高分辨率熔解曲线优化种质鉴定方法。高分辨率熔解曲线可以在分子水平上准确地反映DNA片段的特征，可用于临床疾病的分子诊断与分型、植物遗传图谱构建、基因定位与标记辅助选择、突变检测及种质鉴定等研究[9]。高分辨率熔解曲线应用于植物种质资源鉴定研究，常用于检测SSR或SNP片段[10-12]，具有高通量、高灵敏度、操作简便、检测结果准确性和稳定性好以及无需设计探针，不需重新设计PCR引物等优点[13-14]。

HRM技术对于金银花的种质资源鉴定不受药材原植物生长发育阶段、供试部位等条件的影响，能较好地反映金银花不同品种的遗传多样性，并加以快速鉴定及准确区分。本实验筛选获得4种鉴别引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121，在相应退火温度、循环数为35～40、DNA模板30～60 mg·L^-1进行熔解曲线分析。采取归一化曲线，峰型熔解曲线及主成分分析3种方法相结合进行金银花种质鉴定。其中峰型熔解曲线可从T_m判断，最为简单，但分离度较低；主成分分析方法准确度最高，可鉴定样品量最大，归一化曲线易于数据库化，三者各有特点，可根据实际情况予以选择或相互结合已达到最佳效益。该方法可分别对一线红、亚特红蕾、九丰一号予以区分，其中亚特红蕾来源于红白忍冬、九丰一号为四倍体金银花，对金银花品种选育及后续开发利用具有重要意义。

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[责任編辑 吕冬梅]