牛栏山酒厂优良酿酒酵母的筛选及鉴定

王勇

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

牛栏山酒厂优良酿酒酵母的筛选及鉴定

王勇

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

白酒的发酵过程主要是酒精发酵和风味物质形成的过程。在白酒生产中，酒精发酵过程主要是由酿酒酵母通过糖酵解途径，将发酵中的糖类分解为二氧化碳和酒精，在生成酒精的同时，酿酒酵母还能够生成多种有机酸、高级醇及酯类物质，这些物质在基酒的风味中发挥重要作用。优良性状的酿酒酵母可以起到提高出酒率，增加风味物质含量，节约粮食的目的。牛栏山酒厂针对特定工艺，对大曲及发酵过程中微生物进行分离鉴定，获得20株酿酒酵母菌，并结合生化性能筛选实验，最终筛选出产酒精能力、耐酒精能力、发酵力以及发酵产物方面较为优秀的酿酒酵母菌2株，命名为Y006和Y008。将2株酿酒酵母菌分别制作成强化麸曲添加到酿酒生产实验中，均起到了增加乙酸乙酯，适量控制乳酸乙酯，降低杂醇油含量且提高出酒率的作用。

微生物；产酒精能力；耐酒精能力；酿酒酵母

在白酒生产中，酒精发酵过程主要是由酿酒酵母完成的，优良的酿酒酵母可以起到提高出酒率、改善基酒质量、节约粮食的作用。白酒生产中要求优良的酿酒酵母往往需要具有较强的产酒精能力、较高的耐酒精能力，而且会给成品酒带来优良的风味[1]。根据以上要求，以牛栏山酒厂生产用大曲和酒醅为材料，分离出酿酒酵母菌20株，并进行了耐酒精能力、产酒精能力以及发酵力和发酵产物等多方面的测定。综合分析，最终筛选出生化性能优良的酿酒酵母菌2株，并利用其进行麸曲强化添加实验，取得了良好的实验效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分离纯化用培养基

YPD培养基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L。

1.1.2 TTC培养基

TTC上层培养基：TTC0.5 g、葡萄糖5 g、琼脂15 g、水1000m L。

TTC下层培养基：YPD琼脂培养基。

1.1.3 耐酒精性能筛选培养基

含8%vol～30%vol乙醇的8°麦芽汁培养基：试管内装入10m L灭菌的麦芽汁液体培养基，冷却后加入无水乙醇制成酒精度为8%vol、10%vol、12%vol……28%vol、30%vol的8°麦芽汁培养基。

1.1.4 高粱糖化液培养基

高粱粉碎后按高粱∶水=1∶8的比例混匀后，90℃水浴下糊化90m in，冷却到60℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5m in，双层纱布过滤，按体积加入30 g/100m L葡萄糖。

1.2 酵母的分离纯化及PCR鉴定

1.2.1 酵母菌分离

分别取清香型大曲及入池酒醅1 g，用9m L无菌水稀释，拟定为10-1的浓度。依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，分别吸取10-4、10-5稀释液0.1m L，接种到麦芽汁培养基平板中，用涂布棒均匀涂布。恒温培养箱中28℃培养3 d，肉眼观察培养基平板，根据酿酒酵母形态特征，随机挑选生长形态呈圆形、乳白色、菌落平坦稍凸起、有湿润感、光滑、边缘整齐的单菌落接入到新的麦芽汁培养基平板中，28℃培养3 d后观察菌种是否已纯化彻底，若不纯则按上述方法重新纯化直至出现单一菌种。

1.2.2 酿酒酵母鉴定

挑取少量活化的酵母菌体，于灭过菌的1.5m L离心管内；加入100μL裂解液（100mM Tris，30mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15 Pa灭菌30m in备用）；100℃水浴15m in；加入100μL 2.5M的醋酸钾溶液，冰浴60m in；4℃下13000 r/m in离心5m in，取上清液200μL至0.5m L离心管中；加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），剧烈振荡10m in，13000 r/m in离心15min，移取100μL上清液至0.5m L离心管中；加入100μL预冷的异丙醇，混匀后于-20℃下放置20m in；13000 r/m in离心15m in，弃上清液；用70%的酒精洗涤沉淀2次；沉淀过夜自然干燥；加入50μL已灭菌的超纯水，室温下溶解1 h，-20℃冰箱储藏备用。PCR扩增酵母菌D1/D2区，所用引物及PCR条件见表1。

表1 酵母菌D1/D2区扩增引物及PCR反应条件

PCR产物送公司测序后，用Chromas软件分析测序质量，去除峰图不可靠的部分对DNA序列进行手动校正，用校正后的序列在NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索，比较该菌株在D1/D2序列上亲缘关系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株与实验菌株的碱基差异，近缘模式菌株GenBank序列号。目前所有已知酵母菌的核糖体D1/D2和ITS序列都已上传至数据库中，可在线搜索。因此，可以根据序列同源性初步判断待测菌株的分类地位。

表2 酿酒酵母鉴定结果

本实验中共分离到疑似酿酒酵母35株，通过PCR鉴定后，确定酿酒酵母菌20株，编号为Y001—Y020（见表2）。

2 结果与分析

2.1 酵母的理化筛选实验方法

2.1.1 酵母TTC显色实验

将上述分离出的20株酿酒酵母菌分别接种到TTC显色培养基中，比较颜色深浅，作为其性能的参考，结果见表3。

结果分析：TTC显色剂对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中酶活力的大小，即酵母产酒精能力的强弱。产酒精能力强的酵母菌菌落呈深红色，次之为粉红色，野生酵母呈红色或粉红色，通过TTC显色实验结果看出，Y010、Y002、Y008、Y006、Y020为黑紫红色，颜色最深，初步推断出是产酒精能力最高的，可作为优良酿酒酵母筛选的参考依据。

表3 酵母菌株TTC显色实验

2.1.2 耐酒精性能筛选

将20株酿酒酵母分别接入含8%vol～30%vol乙醇的麦芽汁中，28℃条件下培养60 h，分别在12 h、24 h、48 h和72 h时观察杜氏小管中的产气情况，结果见图1。

图1 耐酒精度实验

结果分析：虽然酒精是酿酒酵母的主要产物，但较高的酒精对酵母的生长依然起到一定的抑制作用。而在白酒发酵环境中，酒精的存在是不可避免的，所以具有较高耐酒精能力的酿酒酵母菌才能在发酵过程中生长良好。由耐酒精度实验柱状图可以看出，Y020耐酒精能力最强，达到20%vol，此外Y001、Y006、Y008、Y014也相对较强。

2.1.3 酿酒酵母发酵性能测定

将纯化好的酿酒酵母入到带发酵栓并含有100m L高粱糖化醪的150m L三角瓶中，发酵栓中装入10m L、5mol/L的硫酸阻止水分蒸发，28℃培养，每日称重，记录每日失重情况，待发酵结束时计算总失重，并测定其酒精含量，结果见图2、图3。

图2 菌株发酵失重图

图3 菌株产酒精图

结果分析：通过菌种发酵失重图和产酒精实验图看出，Y006、Y008、Y020这3株酵母在失重实验和产酒精实验中数值均较高。

分析总结：通过TTC显色实验挑选出颜色最深的5株酵母为Y010、Y002、Y008、Y006、Y020。在耐酒精度实验中Y020为最高值22%vol，Y008为20%vol，Y001、Y006、Y014介于12%vol和16%vol之间。通过以上生化性能筛选实验确定Y006、Y008、Y020为初期优良酿酒酵母，将此3株菌种进行代谢产物分析以挑选最优菌株。

2.1.4 酵母产酯能力的测定

酯类是一类具有芳香性气味的化合物，多数呈果香，是白酒中重要的芳香物质，可在不同程度上赋予酒的香气，并决定香气的品质。

将Y006、Y008、Y020分别挑取1～2环加入到100m L麦芽汁液体培养基中，装好发酵栓，塞紧胶塞，用滴管向发酵栓内加入5mol/L硫酸，直至液面距发酵栓上出气口1 cm为止。置于28℃培养箱中进行发酵，每天摇匀称重，直至恒重。将产酯培养后恒重的发酵液转入500 m L平底烧瓶中，加入100m L、60%vol乙醇进行蒸馏，收集100m L馏分，气相色谱仪分析测定。选取普遍使用的商业用酿酒酵母作为对照参考，见表4。

表4 酵母代谢产物测定(mg/100 mL)

结果分析：从各菌株所产风味物质来看，主要代谢产物为正丙醇、异戊醇、异丁醇、活性戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯等。在清香型白酒中，乙酸乙酯赋予清香型白酒主体风味，Y006和Y008在产乙酸乙酯方面同对照相比提高了23.84%和30.38%；而影响白酒风味的主要杂醇油为正丙醇、异丁醇、异戊醇等，同对照相比，Y006、Y008产异丁醇分别降低了77.67%和60.57%，产异戊醇分别降低了62.59%和66.27%。由表4可看出，Y006、Y008均起到了增加乙酸乙酯，降低杂醇油的作用。

通过TTC显色实验、耐酒精度、菌种发酵失重、产酒精量和产酯产香及杂醇油产量测定，我们将菌株Y006、Y008确定为今后实验选用的优良酿酒酵母菌。

2.2 麸曲的制作

强化麸曲配方：麸皮65%，水35%，搅拌均匀，装入三角瓶中，121℃灭菌30m in。

将纯化的酵母斜面试管菌种取1环，接种到三角瓶中，28℃培养3 d。取出放入40℃烘干箱中烘干备用。

2.3 强化麸曲添加实验

将强化麸曲按投粮比例的3‰分别添加到大曲中拌匀，与大曲混合使用，其余按照清茬大曲酿酒工艺。蒸馏后得到的基酒分别称为Y006基酒、Y008基酒，将不添加强化麸曲的普通工艺的基酒称为对照基酒[4-5]。分别计算出酒率，并将3种基酒分别降度至60%vol，气相色谱测定基酒骨架成分，结果见表5。

表5 基酒色谱骨架成分(mg/100 mL)

从表5可以看出，Y006基酒与Y008基酒同对照相比：在总酯和乙酯含量较对照基酒有不同程度提高。乙酸乙酯含量提高11.00%和39.31%，乳酸乙酯降低15.54%和5.55%，正丙醇含量略有上升，而异丁醇和异戊醇含量有较大幅度下降。出酒率见表6。

表6 添加强化麸曲实验的出酒率

在原粮出酒率方面，添加强化麸曲的出酒率要高于不添加强化麸曲的出酒率，与对照基酒相比，Y006强化麸曲基酒出酒率提高了4.78%，Y008强化麸曲基酒出酒率提高了7.95%。

白酒酿造过程中的酵母主要分为酿酒酵母、产酯酵母以及酵母属的其他微生物，以牛栏山酒厂生产用清香大曲及酒醅为材料分离出酿酒酵母20株。分别进行了TTC显色实验，耐酒精能力、发酵能力和酒精产量的测定。综合考虑，挑选出Y006、Y008、Y020为初期优良酿酒酵母，随后对其进行代谢产物分析。与市售商业酿酒酵母相比，Y006、Y008具有高产乙酸乙酯，同时适当降低杂醇油含量的能力，最终将Y006、Y008确定为优秀酿酒酵母菌株，并制作成强化麸曲添加到酿酒实验中去。从基酒色谱分析及出酒率统计可以看出，添加Y006、Y008酿酒酵母进行强化发酵，有效提高基酒出酒率4.7%～7.9%，每班次全年可增产基酒6.6 t，为企业带来可观的经济效益。同时，通过强化菌种应用可适当提高基酒乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯含量，适量降低杂醇油含量，起到协调酒体，改善酒质的作用，提高了优质酒率。

3 讨论

酿酒酵母作为发酵中众多微生物的一种，在白酒的产酒和产香方面具有重要作用。根据酿酒酵母的理化性能及代谢产物差异，可以简便有效的筛选出优良菌株，并利用强化麸曲的添加方式进行发酵生产，达到改善基酒质量，提高基酒产量的目的。总体而言，优良的酿酒酵母可以起到提高出酒率和优质酒率，节约粮食，降低原酒成本的作用，在白酒企业中具有较高的应用前景。

[1]沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，1998：114-125.

[2]钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京：化学工业出版社，2007：101-102.

[3]陈红歌,王明道.基因工程原理与实验指导[M].北京：中国轻工业出版社，2010：46-58.

[4]王景芝，俞学锋.酵母生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2005：94-283.

[5]肖冬光.白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社，2005：45-55.

Screening and Identification of Quality S.cerevisiae Strains in Niulanshan Distillery

WANG Yong
(Niulanshan Distillery,Beijing 101301,China)

Liquor fermentation is the process of alcoholic fermentation and the formation of flavoring substances.In alcoholic fermentation,sugar is decomposed into carbon dioxide and alcohol through glycolysis by S.cerevisiae.At the same time,a variety of organic acids,higher alcohols and ester compounds are produced.Those substances play important roles in base liquor flavor.It can be concluded that S.cerevisiae strainsw ith excellentperformance are capable of enhancing liquor yield,increasing flavoring compounds content,and saving grains.In this study,20 S.cerevisiae strains were isolated in Niulanshan Distillery.Through biochem ical property screening test,two S.cerevisiae strainsw ith excellent alcohol-producing capability,alcohohol resistance,fermenting power and fermenting productswere finally obtained and they were named Y006 and Y008.The two strainswere used for the preparation of Fuqu and then used respectively in liquor-making,which could increase ethylacetate,controlethyl lactate properly,reduce fusel oil,and increase liquor yield.

microbe;alcohol-producing capability;alcohol resistance;S.cerevisiae

TS262.3；TS261.1；TS261.4；Q93-3

A

1001-9286（2017）04-0061-04

10.13746/j.njkj.2017048

2017-03-03

王勇(1982-)，硕士，高级工程师，国家级白酒评酒委员。