卵巢癌细胞系SKOV3培养上清对巨噬细胞共刺激分子的影响

宋玉霞 赵涛 张玮璨 郭清 王宏卫 孟桐羽

·论著·

卵巢癌细胞系SKOV3培养上清对巨噬细胞共刺激分子的影响

宋玉霞 赵涛 张玮璨 郭清 王宏卫 孟桐羽

目的 研究卵巢癌细胞系SKOV3培养上清处理巨噬细胞后,巨噬细胞亚型的改变，以及CD80、CD86、CD40在不同巨噬细胞亚型上表达的差异。方法 Ficoll 密度梯度法分离健康成人外周血单个核细胞，GM-CSF诱导为巨噬细胞(M0)后，用对数生长期的SKOV3细胞培养上清处理14 d后，采用流式细胞术检测巨噬细胞亚型的改变及不同亚型细胞CD80、CD86和CD40的表达情况。结果 流式细胞术检测显示，用SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞14 d后，巨噬细胞主要向CD163-M2型巨噬细胞分化[M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]。CD163-M2型巨噬细胞CD40的表达较CD64-M1型显著降低，2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；而CD80、CD86的表达无明显改变，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论SKOV3细胞培养上清刺激后的巨噬细胞向不同巨噬细胞亚型分化；M2型巨噬细胞较M1型巨噬细胞共刺激分子表达下调，提示这些共刺激分子在巨噬细胞的活化及免疫应答过程中很重要，可能与肿瘤细胞的免疫逃逸有关。

卵巢癌；M2型巨噬细胞；CD80/CD86/CD40

卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度最高的疾病，腹膜转移是晚期卵巢癌的特征之一。晚期卵巢癌患者腹水微环境的浸润细胞包括内皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等等，其中巨噬细胞是含量最丰富的免疫细胞。近年来研究发现，M2型巨噬细胞浸润数量和卵巢癌预后有显著的相关性[1]。本课题组前期研究发现，在卵巢癌晚期患者腹水中，主要是M2型巨噬细胞，而非M1型巨噬细胞。这提示M2型巨噬细胞在肿瘤的增殖及远处转移中发挥重要作用。查阅文献发现，M1型巨噬细胞和M2型在某些细胞因子的表达上有所差异[2]。本实验通过研究CD68、CD80及CD40在M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞表达的差异，初步筛选出肿瘤细胞中的关键分子靶点，为解释卵巢癌的腹腔播散和转移提供新的线索，并为卵巢癌分子靶点的干预策略提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 1640培养基，卵巢癌细胞系SKOV3。

1.2 方法

1.2.1 采集健康成人外周血，Ficoll 密度梯度法收集中间层单个核细胞(1 000 r/min，20 min，23℃)， PBS重悬后再次离心 (800 r/min，7 min，23℃)。

1.2.2 巨噬细胞培养：细胞以不含血清的RPMI1640重悬后种于100 mm细胞培养皿，细胞种植密度为1.0×106/ml，培养箱中静置 2 h 使细胞贴壁，用预热的PBS润洗3次， 除去悬浮细胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF，置入37℃,5%CO2培养箱培养，备用。

1.2．3 用对数生长期的SKOV3细胞培养上清处理14 d后，以免疫荧光的方式鉴定分离培养巨噬细胞纯度。细胞刮轻刮培养皿收集巨噬细胞，离心收集细胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23℃。弃上清，以CD68抗体标记巨噬细胞，37℃，1 h。PBS洗涤3遍，标记荧光二抗，37℃，1 h。PBS洗涤3遍，Hocest染核5 min。PBS洗涤3遍，荧光显微镜观察，统计。

1.2.4 SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞：用对数生长期的SKOV3细胞培养上清处理M0巨噬细胞14 d。

1.2.5 巨噬细胞各亚型比例的检测：以CD64作为M1型巨噬细胞的表面标记，以CD163作为M2型巨噬细胞的表面标记。收集细胞，取1.0×106个细胞，标记上述荧光抗体，流式细胞学检测M1、M2所占百分。

1.2.6 巨噬细胞CD80、CD86和CD40的表达的检测：收集SKOV3细胞培养上清处理14 d后的细胞，取1.0×106个细胞，标记荧光抗体M1、M2及CD80、CD86和CD40，流式细胞学检测M1、M2中CD80、CD86和CD40的表达情况。

2 结果

2.1 流式细胞术检测巨噬细胞表面标记(CD64，CD163)表达情况SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞14d后，M1型巨噬细胞占(12.37±1.76)%，M2型巨噬细胞占(22.23±2.21)%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见，SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞14d后，M0主要向M2型巨噬细胞分化。见图1。

2.2 不同巨噬细胞亚型中，CD80、CD86和CD40表达的检测SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞14d后，流式细胞术检测不同细胞因子的表达情况，结果如下图。CD80在CD64-M1、CD64-M2上表达所占百分比分别为：(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%，2组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CD86在CD64-M1、CD64-M2上表达所占百分比分别为：(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%，2组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CD40在CD64-M1、CD64-M2上表达所占百分比分别为：(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%，2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

图1 流式细胞术检测巨噬细胞表面标记(CD64，CD163)表达情况

图2 不同巨噬细胞亚型中，CD80、CD86和CD40的表达的检测

图3 不同巨噬细胞亚型中，CD80、CD86和CD40的表达的检测

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统肿瘤中死亡率最高的疾病。近年来，对于恶性肿瘤的治疗出现了一些分子靶向治疗药物，像Herceptin,Gleevec,Sorafenib等。但是卵巢癌的分子靶向治疗药物仍未获得突破性进展。分子靶向药物在临床应用中暴露的一些问题使得人们逐渐把目光转移到生物免疫治疗上来。腹腔巨噬细胞与卵巢癌肿瘤细胞相互作用的研究，对揭示卵巢癌恶性表型有重要意义，同时还能对卵巢癌的免疫治疗提供理论基础。卵巢癌与免疫微环境相互作用的研究与日俱增，为阐明卵巢癌恶性表型机制提供新的线索。

研究发现：腹腔微环境对卵巢的进展与播散用重要作用，晚期卵巢癌患者多有恶性腹水形成，腹水中富含肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，TAM对卵巢癌耐药与播散有重要意义[1]。在晚期恶性腹水中分离出的肿瘤TAM高表达CD163，这种CD163的高表达与卵巢癌的早期复发和腹水IL-6、IL-10的表达水平相关。朱亚飞等[2]研究发现：卵巢癌组织中存在M0向M2型的分化，且M2细胞比例是卵巢癌预后不良的预测因素。M2细胞百分比是卵巢癌预后的负相关因素,M1、M2密度与卵巢癌预后无关。而卵巢癌组患者生存率曲线显示,M2密度及M2细胞百分比与患者生存时间有关。可见M2细胞比例是影响卵巢癌预后的因素。

张婷等[3]研究发现：EOC腹膜内激活的因子与浸润TAM相互作用关系,提示EOC微环境内 激活的因子可能是诱导外周血单核细胞和巨噬细胞(MO/MA)分化和极化为M2型细胞的一个新的分子,表明EOC微环境中凝血系统的因子除直接作用肿瘤细胞外,还通过作用于基质内巨噬细胞促进肿瘤的侵袭、浸润及血管生成。很有可能凝血因子与在EOC种植灶附近MO/MA相互作用产生的趋化因子、细胞因子网络为肿瘤细胞沿腹膜表面种植铺平了道路。另研究发现：卵巢癌恶性进展与卵巢癌微环境密切相关，通过构建腹腔炎性环境老鼠模型，人卵巢癌腹腔注射，观察腹腔炎性环境对卵巢癌进展的影响，发现腹腔炎性环境能够促进卵巢的腹腔播散和腹水形成[4]。并且这种现象和腹腔巨噬细胞，间皮细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)密切相关。

值得注意的是Tanaka等[5]在对89例卵巢癌患者的回顾性研究中发现:TAMs分泌的Bikunin是一种Kunitz-type蛋白酶抑制剂,通过下调uPA的表达,为无瘤生存率(P=0.040)和总生存期(P=0.042)提高的一项独立的预后因素。这个结果与上述其他研究对TAMs在肿瘤预后上的结论不一。

宿主抗肿瘤免疫反应可明显改善卵巢癌患者的预后及生存率，通过加强卵巢癌患者的宿主抗肿瘤免疫反应，可显著影响卵巢癌患者的预后[6]。已有研究表明，M2型巨噬细胞可以减弱急性期炎症反应，抑制免疫应答，促进肿瘤细胞的增殖及迁移能力，并能够诱导局部免疫耐受状态[7]。通过本实验可以发现，用SKOV3培养上清处理后的巨噬细胞，除了亚型转变之外，还有共刺激分子(CD86、CD80、CD40)的改变，这些共刺激分子在巨噬细胞的活化及免疫应答过程中很重要，共刺激分子表达降低会导致巨噬细胞不能产生杀伤肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。其中表达降低的主要是CD40。CD40可以促进凋亡和Fas基因的表达，并且可以加强抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。

在单核巨噬细胞中，CD40与CD40的受体CD40L结合后可上调其表面的CD54、CD80、CD86及MHCII的表达，增强抗原递呈的作用[8],这也可能是该实验中CD86在M2型巨噬细胞的表达与M1型巨噬细胞无明显差异的原因；CD40-CD40L还可以促进IL-6、IL-8、IL-12和MMPs的分泌[9]。活化的Th2细胞高表达CD40L,可与B细胞表面的CD40结合,产生B细胞活化的第二信号,协同刺激B细胞活化、增殖和分化成浆细胞并产生抗体，如果CD40-CD40L的相互反应中断可诱导B细胞的免疫耐受[10]。CD40 与肿瘤血管形成有关,可促进肿瘤细胞的生长[11]。然而,CD40-CD40L结合反应可诱导肿瘤细胞凋亡,促进抗原提呈细胞的活化,产生抗肿瘤的免疫反应。CD40L可抑制IL-10和TGF-β的产生,诱导肿瘤部位的Th1反应,进而抑制肿瘤的发生[12]。激活的T细胞通过CD40-CD40L反应调节内皮细胞上MMPs表达，内皮细胞上CD40的表达又可诱导上皮细胞MMP-9表达，提高MMP-1和MMP-3的水平，激活MMP-2。内皮细胞上CD40的表达可引起血管重建，从而为肿瘤的浸润和转移提供物质基础[13]。原发性和复发性卵巢癌组织以及卵巢癌腹水中均可检测到CD40，腹水中CD40含量明显高于实体肿瘤组织中CD40的表达，在原发性卵巢癌中的表达又明显高于复发卵巢癌组织[14]。因此，CD40表达水平的检测可作为复发卵巢癌检测的指标之一。CD40在肿瘤的基因治疗中已得到越来越多的应用。CD40、CD40L以及CD40/CD40L的结合反应与癌细胞间作用的分子机制相当复杂，需要进一步研究来阐明它们之间的关系。

目前，不同学者对TAM与卵巢癌的相互作用提出各自看法，基本集中在肿瘤组织、腹膜、肠系膜中TAM的密度、比率或者分泌的细胞因子与卵巢癌预后的关系等方面。不同研究对TAM与卵巢癌预后关系也说法不一。对其研究多停留在与预后关系的报道，但相互作用的具体机制、特异的分子靶点报道较少，而这正是指导免疫靶向治疗的关键，是有待我们进一步阐明的问题。

1ReinartzS,SchumannT,FinkernagelF,etal.Mixed-polarizationphenotypeofascites-associatedmacrophagesinhumanovariancarcinoma:correlationofcd163expression,cytokinelevelsandearlyrelapse.IntJCancer,2014,134:32-42.

2 朱亚飞,胡爱民,张振东,等.卵巢癌组织中m2型巨噬细胞密度变化及其与卵巢癌预后的关系.山东医药,2011,51:7-9.

3 张婷,马政文,王颖,等.凝血因子Ⅱ可诱导单核细胞和巨噬细胞分化为卵巢癌腹膜内肿瘤相关巨噬细胞.中国实用妇科与产科杂志,2009,4:29-32.

4Robinson-SmithTM,IsaacsohnI,MercerCA,etal.macrophagesmediateinflammation-enhancedmetastasisofovariantumorsinmice.CancerRes,2007,67:5708-5716.

5TanakaY,KobayashiH,SuzukiM,etal.Upregulationofbikuninintumor-infiltratingmacrophagesasafactoroffavorableprognosisinovariancancer.GynecolOncol,2004,94:725-734.

6Mantia-SmaldoneGM,ChuCS.immunotherapyinovariancancer.HumVaccineImmunother,2012,8:1179-1191.

7AlbertoMantovani,PaolaAllavena,AntonioSica,etal.Cancer-relatedinflammation.Nature,2008,454:436-444.

8Feder-MengusC,Schultz-ThaterE,OertliD,etal.NonreplicatingrecombinantvacciniavirusexpressingCd40ligandenhancesapccapacitytostimulatespecificCd4+andCd8+Tcellresponses.HumGeneTher,2005,16:348-360.

9ScottK,ManuntaM,GermainC,etal.Qualitativelydistinctpatternsofcytokinesarereleasedbyhumandendriticcellsinresponsetodifferentpathogens.Immunology,2005,116:245-254.

10LoskogA,DzojicH,VikmanS,etal.AdenovirusCd40ligandgenetherapycounteractsimmuneescapemechanismsinthetumorenvironment.JImmunol,2004,172:7200-7205.

11ThorstenV,KatherineC,WoodR,etal.DifferentialexpressionandregulationofmurineCd40inregionalvascularbeds.AmericanJournalofPhysiology.HeartandCirculatoryPhysiology,2006,290:631-639.

12AndradeRM,WessendarpEA.Tnfreceptor-associatedfactor6-dependentCd40signalingprimesmacrophagestoacquireantimicrobialactivityinresponsetotnf-alpha.TheJournalofImmunology,2005,175:6014-6021.

13Smola-HessS,SchnitzlerR,HadaschikD,etal.Cd401inducesmatrix-metalloproteinase-9butnottissueinhibitorofmetalloproteinases-1incervicalcarcinomacells:imbalancebetweennf-kappabandstat3activation.Experimentalcellresearch,2001,267:205-215.

14CiaravinoG,BhatM,ManbeianCA,etal.Differentialexpressionofcd40andCd95inovariancarcinoma.Europeanjournalofgynaecologicaloncology,2004,25:27-32.

Effects of culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 on costimulatory molecules of macrophages

SONGYuxia*,ZHAOTao*,ZHANGWeican,etal.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the changes of subtypes of macrophage treated by culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 in vitro,and to explore the differences of expressions of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophage.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy adults by Ficoll density gradient method,which were induced into macrophages by GM-CSF.Then the macrophages were cultured in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells at exponential growth phase for 14 days. The changes of subtypes of macrophage and the expression levels of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophages were detected by flow cytometry.Results The examination results by flow cytometry showed that after the macrophages were treated in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells for 14 days, the macrophages were mainly differentiated into CD163-M2 subtype macrophages [M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]. The expression levels of CD40 in CD163-M2 subtype macrophages were significantly decreased,as compared with those in CD64-M1 subtype macrophage (P<0.05).HowevertherewerenosignificantdifferencesintheexpressionlevelsofCD80andCD86betweentwogroups(P>0.05).Conclusion After the macrophages are treated in culture supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells,which are differentiated into different subtypes.Moreover the expression levels of costimulatory molecules are down-regulated in M2 subtype macrophages,as compared with those in M1 subtype macrophages ,which suggests that these costimulatory molecules play an important role in activation of macrophages and immune response,which may be correlated to immune escape of tumor cells.

ovarian carcinoma;M2 subtype macrophages; CD80/CD86/CD40

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.006

050011 河北省石家庄市第一医院妇产科(宋玉霞、赵涛、郭清、王宏卫、孟桐羽)；河北医科大学(张玮璨)

郭清，050011 河北省石家庄市第一医院妇产科；

E-mail:syx810511@126.com

R

A

1002-7386(2017)08-1144-04

2016-12-13)