不同产区青稞根部可培养内生固氮菌的多样性研究

刘振东，岳 筱，王 波，薛 蓓，王强锋

(1.西藏农牧学院食品科学学院，西藏林芝 860000； 2.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨 850032； 3.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川成都 610061)

不同产区青稞根部可培养内生固氮菌的多样性研究

刘振东1，岳 筱1，王 波2，薛 蓓1，王强锋3

(1.西藏农牧学院食品科学学院，西藏林芝 860000； 2.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨 850032； 3.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川成都 610061)

为认识青稞内生固氮菌群落组成，丰富内生固氮菌资源，明确产地对青稞内生固氮菌多样性的影响，本研究利用纯培养技术分别对在拉萨、林芝、日喀则栽培的藏青2000根部内生固氮菌进行分离、纯化，并测定各菌株的固氮酶活性及高固氮酶活性菌株的溶磷、溶钾及产IAA特性，最后，通过16S rDNA基因测序和构建系统发育树研究了高固氮酶活性菌株的分类学地位。结果显示，通过Ashby培养基分离、纯化得到内生固氮菌37株，其中，具有高固氮酶活性的11株，占总分离菌株27%，有6株菌株具有分泌IAA的能力，2株具有溶钾能力，1株具有溶磷能力。16S rDNA测序结果表明，11株高固氮酶活性的菌中，有5株菌属于Bacillus，为优势菌属，其余菌株分别属于Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia。

青稞；根；内生固氮菌；多样性

氮素是植物生长发育过程中需求量最大的养分，也是植物生态系统中最常见的限制因子[1]。虽然空气中含有大量的氮元素，但不能被植物直接利用，必须通过以植物为寄主的固氮微生物转化后才能被利用[2-4]。固氮微生物的宿主范围十分广泛，相关学者已从小麦、玉米、高粱等多种农作物上分离并鉴定得到了多种内生固氮菌，且不同种植区域、不同农作物品种的内生固氮菌种属及丰度存在较大差异[5]。植物内生固氮菌是指能够定殖在植物体内、与宿主植物联合固氮、且对宿主无害的微生物，是生物肥料的良好资源。

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)是禾本科大麦属的禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称为裸大麦[6]。青稞是藏族传统主食糌粑的主要原料，同时又是宗教节日中藏族人民以示祝福的祭示物，有着不可替代的物质及精神双重属性，所以青稞的生产历来受到国家和西藏自治区人民政府的高度重视。近年来，人们逐渐认识到青稞“三高两低”(高蛋白、高可溶性纤维元素、高维生素和低脂肪、低糖)的营养价值，其丰富的β-葡聚糖是降血脂、降胆固醇和预防心血管疾病的佳品[7-8]。因此，青稞除传统食用形式外，已逐渐被开发成青稞饼干、青稞米饼等多种形式的商品。随着青稞不断外销和加工成各类食品，对西藏青稞生产提出了更高的要求。

本研究通过纯培养技术和分子生物学手段对西藏日喀则、拉萨、林芝栽培的主要青稞品种藏青2000的根部内生固氮菌进行分离及遗传多样性分析，并对固氮菌的固氮活性进行初步研究，以期揭示青稞根部内生固氮菌种群特征，为丰富内生固氮菌种质资源库、开发利用青稞内生固氮菌资源及研制更加安全环保的生物肥料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.1.1 采样时间及地点

2014年7月13日分别在海拔3 658 m的拉萨市西藏自治区农科院青稞试验田、海拔2 860 m的林芝市西藏大学农牧学院实习农场青稞试验田和海拔3 836 m的日喀则市农科所青稞栽培基地取青稞品种藏青2000样品，各样点土壤肥力中等，青稞生长良好。

1.1.2 采样方法

于灌浆期在试验田约300 m2区域内采用对角线5点法采集样品，每点采青稞整株3株，每个小区采15株；摇晃去掉根部土壤，用无菌剪分别剪下根部并放入50 mL无菌离心管中，迅速拧紧管盖，并用PE膜封口贴上标签，置于4 ℃保温箱中迅速带回实验室。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 固氮菌的分离与种群密度测定

将青稞根系用无菌水洗 3 次，每次3 min；用吸水纸吸去根系表面水分，70%酒精中浸泡 2 min；无菌水洗 3 次，3%NaClO 浸泡 2 次，每次 1 min；用无菌水冲洗 3 次，每次 2 min，将最后一次的冲洗液涂布于Ashby培养基上，培养基上无菌落产生证明表面消毒完全。

消毒后的青稞根系用无菌研钵研磨成浆，静置后，吸取上清液，稀释至10-3～10-7的不同浓度梯度，分别吸取各稀释浓度的提取液100 μL，涂布于Ashby培养基上，每个稀释度设置3个重复，28 ℃倒置培养3～4 d，挑取差异菌落纯化，镜检，斜面保藏，分析其固氮酶活性。

1.2.2 菌株的生理特性测定

固氮酶活性采用乙炔还原法[9]测定。溶磷、溶钾能力采用溶解圈法，测定菌株在Pikovaskaia培养基、硅酸盐细菌培养基上溶解圈的直径，以溶解圈直径与菌落直径比值(HD/CD)作为内生固氮菌的溶磷、溶钾能力指标[10]。分泌IAA能力采用 Salkowski 比色法[11]测定。

1.2.3 基因组 DNA提取与16S rDNA 的PCR扩增

将保存的固氮菌菌株活化后接种于Ashby培养基上，28 ℃培养2 d，挑取单菌落采用CTAB法提取基因组DNA，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检查DNA纯度。以基因组 DNA 为模板、上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3′)、下游引物1492R(5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)进行菌株16S rDNA 基因片段扩增。PCR反应体系为：2×TaqMaster Mix 15 μL，Primer 27F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer 1492R(10 μmol·L-1)1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延长1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物的测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.2.4 系统发育树的构建及分析

将菌株的测序结果在NCBI中进行BLAST比对，并下载与之相似性最高的菌株16S rDNA序列，采用MEGA 5.1软件用Neighbor-joining方法进行发育树构建。

2 结果与分析

2.1 内生固氮菌的种群密度

由3个产地的青稞根样中，共分离到内生固氮菌37株，种群密度属于同一数量级，但数量上有一定差异，其种群密度依次为：日喀则(0.25×104cfu·g-1)> 拉萨(0.22×104cfu·g-1)> 林芝(0.16×104cfu·g-1)。

2.2 内生固氮菌的固氮酶活性、溶磷、溶钾能力和产IAA能力

3个青稞主产区藏青2000根部分离得到的37株内生固氮菌中，有11株固氮菌的固氮酶活性高于0.8 nmol·h-1·mL-1，其中，日喀则样本5株，拉萨样本4株，林芝样本2株。酶活性以来自日喀则样本的RKZ10菌株最高，其固氮酶活性为2.98 nmol·h-1·mL-1(表1)。

在固氮能力高的11株内生固氮菌中，有两株菌株(LS17、LZ32)具有溶钾特性，只有LS17具有溶磷特性，具有产IAA能力的菌株有6株。

2.4 16S rDNA 序列分析与系统发育树构建

对11株高固氮酶活性菌株的16S rDNA序列在NCBI中进行Blast，查询与其相似性最高的序列，在Mega 5.1软件中通过Clustal W进行多序列比较后采用Neighbor-joining方法进行发育树构建，结果发现，这11株菌株分别属于Bacillus、Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia，其中，Bacillus为优势菌属(5株)，在林芝、日喀则和拉萨三个地区的根样中均有分离株。Gemmatimonas、Agrobacterium为拉萨特有种属，Sphingomonas、Mesorhizobium为林芝特有种属，Devosia、Burkholderia为日喀则特有种属。

表1 内生固氮菌的生理特征

nd：未检测到。

nd:Not detected.

括号中序号表示序列的Genebank登录号。

Numbers in brackets represent Genebank accession number.

图1 高固氮酶活性菌株 16S rRNA 基因序列的系统发育分析

Fig.1 Phylogeny constructed by 16S rDNA sequences of the high nitrogenase activity strains

3 讨 论

非豆科植物固氮能力的研究，一直是内生菌研究的热点，关于小麦、玉米、水稻等禾本科农作物的内生固氮菌的研究已有报道，且在农业上具有较大的应用潜力[12-15]。而针对青稞的研究主要集中在在青稞营养成分、栽培管理方法及青稞植株基因分析等方面。目前，针对青稞内生固氮菌的研究还未见相关报道。本研究利用纯培养技术对青稞根部内生固氮菌进行分离，虽然纯培养法由于培养条件等限制，在研究微生物群落多样性时，还需要结合多种现代生物化学及分子生物学技术更详细地阐明微生物群落状况[16]。但是，该方法在微生物资源开发和利用中起着重要的作用[17]，且只有能够经过人工培养的内生固氮菌才有开发利用的潜在价值。

西藏耕种土壤养分基本状况为氮素偏低，本研究发现，青稞根部内生固氮菌多样性较为丰富。林芝、拉萨、日喀则三地均为高海拔地区，三个地区同一品种优势内生固氮菌均为芽孢杆菌，其可能的原因之一是季节性冻融的影响，芽孢杆菌因能形成芽孢休眠体而具有较高的抗逆性[18]。3个产区内生固氮菌种属差异较大，林芝、拉萨、日喀则三地气候是由湿润向半湿润、半干旱过渡，土壤由黄棕壤向山地灌丛草原土、亚高山草甸土过渡，有机质含量由高至低，土壤pH值由低至高[19]，土壤性质及气候不同可能是藏青2000根部内生固氮菌种属存在差异的主要原因。

4 结 论

藏青2000根部内生固氮菌多样性较为丰富，且不同地区的内生固氮菌多样性存在一定差异。

[1] 慈 恩,高 明.生物固氮的研究进展[J].中国农学通报,2004,20(1):26.

CI E,GAO M.Research progress on biological nitrogen fixation [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2004,20(1):26.

[2] STURZ A V,CHRISTIE B R,NOWAK J.Bacterial endophytes:Potential role in developing sustainable systems of crop production [J].CriticalReviewsinPlantSciences,2000,19(1):20.

[3] YUAN H J,YAN H,YANG F,etal.Molecular characterization and phylogenetic analysis of endophytic nitrogen molecular characterization and phylogenetic analysis of endophytic nitrogen fixing bacteria inOryzaaustraliensis[J].ChineseJournalofAppliedandEnvironmentalBiology,2014,20(4):573.

[4] GUPTA G,PANWAR J,JHA P N.Natural occurrence ofPseudomonasaeruginosa,a dominant cultivable diazotrophic endophytic bacterium colonizingPennisetumglaucum(L.) R.Br.[J].AppliedSoilEcology,2013,64:256.

[5] 孙建光,罗 琼,高 淼,等.小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育[J].中国农业科学,2012,45(7):1310.

SUN J G,LUO Q,GAO M,etal.Isolation and phylogeny of nitrogen-fixing endophytic bacteria in wheat,rice,maize,Chinese cabbage and celery [J].ScientiaAgriculturaSinica,2012,45(7):1310.

[6] 孟亚雄,孟祎林,汪军成,等.青稞遗传多样性及其农艺性状与SSR标记的关联分析[J].作物学报,2016,42(2):182.

MENG Y X,MENG Y L,WANG J C,etal.Genetic diversity and association analysis of agronomic characteristics with SSR markers in hulless barley [J].ActaAgronomicaSinica,2016,42(2):182.

[7] 马瑞萍,韦泽秀,卓 玛,等.氮磷配施对青稞生长发育及产量的影响[J].西南农业学报,2015,28(6):2580.

MA R P,WEI Z X,ZHUO M,etal.Effect of mixed application of N and P on growth and yield of highland barley [J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,2015,28(6):2580.

[8] 侯亚红,强小林.西藏河谷农区灌水和中后期降雨对高产青稞耗水量与产量的影响[J].中国农学通报,2015,31(26):171.

HOU Y H,QIANG X L.Effect of irrigation and rainfall on water consumption characteristics and yield of high yield highland barley in tibet river valley [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2015,31(26):171.

[9] 孟宪法,隆小华,康 健,等.菊芋内生固氮菌分离、鉴定及特性研究[J].草业学报,2011,20(6):159.

MENG X F,LONG X H,KANG J,etal.Isolation and identification of endogenic nitrogen-fixing bacteria in the roots of jerusalem artichoke(Helianthustuberosus)[J].ActaPrataculturaeSinica,2011,20(6):159.

[10] 王秀呈,曹艳花,唐 雪,等.水稻内生固氮菌Herbaspirillum seropedicae DX35的筛选及其促生特性[J].微生物学报,2014,54(3):294.

WANG X C,CAO Y H,TANG X,etal.Rice endogenous nitrogen fixing and growth promoting bacteriumHerbaspirillumseropedicaeDX35 [J].ActaMicrobiologicaSinica,2014,54(3):294.

[11]BRIC J M,BOSTOCK R M,SILVERSTONE S E.Rapid in situ assay for indoleacetic acid production by bacteria immobilized on a nitrocellulose membrane [J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1991,57(2):536.

[12] LUPWAIY N Z,CLAYTON G W,HANSON K G,etal.Endophytic rhizobia in barley,wheat and canola roots[J].CanadianJournalofPlantScience,2004,84(1):39.

[13] 杨慧林,张志斌,颜日明,等.东乡野生稻内生放线菌Streptomycessp.PRh5 的全基因组测序及序列分析[J].微生物学通报,2015,42(4):804.

YANG H L,ZHANG Z B,YAN R M,etal.Whole-genome sequencing and analysis of an endophytic actinomyceteStreptomycessp.PRh5 from Dongxiang wild rice [J].MicrobiologyChina,2015,42(4):804.

[14] 王志伟,纪燕玲,陈永敢.禾本科植物内生真菌及其在农业上的应用潜力[J].南京农业大学学报,2011,34(5):147.

WANG Z W,JI Y L,CHEN Y G.Grass endophytes and their potential applications in agriculture [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2011,34(5):147.

[15] 姜晓宇,高菊生,徐凤花,等.水稻种子内生细菌多样性及其分泌植物生长素能力的测定[J].微生物学报,2013,53(3):270.

JIANG X Y,GAO J S,XU F H,etal.Diversity of endophytic bacteria in rice seeds and their secretion of indole acetic acid [J].ActaMicrobiologicaSinica,2013,53(3):270.

[16]SUN X,GUO L D.Endophytic fungal diversity:Review of traditional and molecular techniques [J].Mycology,2012,3(1):68.

[17] ZHAO K,PENTTINEN P,GUAN T W,etal.The diversity and antimicrobial activity of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants in Panxi plateau,China [J].CurrMicrobiol,2011,62:186.

[18] 杨思忠,金会军.冻融作用对冻土区微生物生理和生态的影响[J].生态学报,2008,28(10):5067.

YANG S Z,JIN H J.Physiological and ecological effects of freezing and thawing processes on microorganisms in seasonally froze ground and in permafrost [J].ActaEcologicaSnica,2008,28(10):5067.

[19] 钟国辉,田发益,旺 姆,等.西藏主要农区农田土壤肥力研究[J].土壤学报,2005,42(6):1034.

ZHONG G H,TIAN F Y,WANG M,etal.Soil fertility of croplands in major agricultural areas in Tibet [J].ActaPedologicaSinica,2005,42(6):1034.

Diversity of Culturable Endophytic Nitrogen-Fixing Bacteria in Naked Barley Roots from Different Production Regions

LIU Zhendong1, YUE Xiao1, WANG Bo2, XUE Bei1, WANG Qiangfeng3

(1.Department of Food Science, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College, Nyingchi, Tibet 860000, China; 2.Agricultural Institute, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa, Tibet 850032, China; 3.Institute of Biological&Nuclear Technology Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu, Sichuan 610061, China)

In order to understand the community composition of endophytic nitrogen-fixing bacteria in the naked barley, and the effect of planting regions on the diversity of endophytic nitrogen-fixing bacteria, endophytic nitrogen-fixing bacteria in naked barley roots from different planting regions were isolated and their diversity was investigated. In this study, culture techniques were used to isolate and purify endophytic nitrogen-fixing bacteria from the roots of naked barley ZQ2000 planted in Lhasa, Nyingchi, and Xigaze. Nitrogenase activity of the strains was determined, and dissolved phosphorus and potassium and characteristics of IAA production of the strains with high nitrogenase activity were examined. Taxonomy of the strains with high nitrogenase activity was studied by 16S rDNA gene sequencing and phylogenetic tree construction. The results showed that 37 endophytic nitrogen-fixing bacteria were isolated and purified using Ashby medium, including eleven strains with high nitrogenase activity, accounting for 27% of the isolates. While among these eleven strains with high nitrogenase activity, six strains were capable to secrete IAA, and two strains were capable to dissolve potassium, and one strain were capable to dissolve phosphorus. The results of 16S rDNA sequencing showed that five of the eleven strains with high nitrogenase activity belonged toBacillus, which was the dominant genus, and the rest strains belonged toGemmatimonas,Sphingomonas,Devosia,Agrobacterium,MesorhizobiumandBurkholderia.

Naked barley; Root; Endophytic nitrogen-fixing bacteria; Diversity

时间：2017-04-07

2016-07-16

2016-08-09 基金项目：西藏自治区青年教师创新计划项目(QCZ2016-45);西藏自治区自然科学基金项目(2015212-14-23); 国家现代农业(大麦、青稞)产业技术体系加工试验站项目(CARS-05)

E-mail：liu304418091@126.com

王强锋(E-mail:wqf198808@126.com)

S512.3；S314

A

1009-1041(2017)04-0565-05

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170407.1021.040.html