Bcl-2和PCNA表达在大鼠成肌细胞氧化应激损伤中的作用*

毛挺挺， 郑亚华， 方红波， 谢鲁吉， 张伟丹， 姜丽萍

(1宁波市医疗中心李惠利东部医院， 浙江 宁波 325000； 2上海交通大学医学院附属新华医院， 上海 200092)

Bcl-2和PCNA表达在大鼠成肌细胞氧化应激损伤中的作用*

毛挺挺1， 郑亚华1， 方红波1， 谢鲁吉1， 张伟丹1， 姜丽萍2△

(1宁波市医疗中心李惠利东部医院， 浙江 宁波 325000；2上海交通大学医学院附属新华医院， 上海 200092)

目的： 探讨Bcl-2、PCNA等蛋白表达在成肌细胞氧化应激损伤中的意义。方法: 将对数生长期成肌细胞进行分组，结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预处理2 h及过氧化氢处理，分为正常对照(control)组、单纯bFGF组、氧化应激组(H2O2组)和干预组(bFGF+H2O2组)。免疫组化检测Bcl-2和Bax阳性沉积颗粒；免疫荧光观察成肌细胞形态及Bcl-2和Bax荧光表达；Western blot检测Bcl-2、PCNA等蛋白表达情况。结果: 免疫荧光及免疫组化结果显示，与氧化应激组比较，干预组Bcl-2表达增加，Bax表达减少；Western blot显示，干预组Bcl-2和PCNA水平增加，Bax水平降低。结论: 氧化应激诱导的大鼠成肌细胞损伤参与肌细胞病理进程。Bcl-2和PCNA表达上调可减轻成肌细胞损伤程度。

深部组织损伤； 氧化应激； L6成肌细胞； 碱性成纤维细胞生长因子

以往压疮研究集中于局部皮损及破溃范围，往往忽视皮肤完整性深部组织损伤(deep tissue injury，DTI)的发生。近年来研究显示，压疮受累组织尤以肌层最易损伤[1]。缺血再灌注为DTI形成重要机制，大量氧自由基及肌细胞损伤等病理反应集中于缺血再灌注过程之中，并在DTI恶化进程中起到重要作用[2-3]。目前已有报道显示，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能够有效缓解大鼠深部肌组织损伤[4]，然而尚未有研究阐明bFGF与压疮肌细胞氧化应激间的关系。因此，本研究通过体外模拟压疮氧化应激过程，检测Bcl-2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等蛋白表达，探讨bFGF具体作用，以期在细胞水平为压疮肌组织损伤防治提供一定思路。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠成肌细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，采用含1%青/链霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，置细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)进行常规培养，2～3 d传代1次，待其生长至对数期时，以0.25%胰蛋白酶消化后进行分组实验。

重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)由温州生物与天然药物研究所提供；过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)购自Sigma；胎牛血清、胰蛋白酶、青/链霉素和DMEM高糖基础培养基均为Gibco产品；Hoechst 33258购自碧云天生物科技有限公司；兔单克隆抗Bcl-2、Bax抗体，鼠单克隆抗PCNA、GAPDH抗体及实验中所用的 II 抗羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、羊抗兔IgG-HRP、驴抗兔IgG-FITC均由Santa Cruz提供。

2 主要方法

2.1 实验分组及干预 常规进行细胞培养，待细胞生长为指数增长期后，统一换液。根据有无H2O2及bFGF干预可分为4组：正常对照(control)组、单纯bFGF组、氧化应激组(H2O2组；H2O2浓度及作用时间的确定参照文献研究方法及我们前期体外DTI细胞氧化应激模型构建过程[5-6])和干预组(bFGF+H2O2组；bFGF浓度综合参考文献[7-8]选择)。正常对照组不做任何处理；单纯bFGF组提前给予100 μg/L bFGF 2 h；氧化应激组采用100 μmol/L H2O2培养基处理4 h；干预组给予100 μg/L bFGF预给2 h后，加入100 μmol/L H2O2继续孵育4 h。

2.2 SABC免疫组化 采用SABC法，4%多聚甲醛固定，3% H2O2-甲醇溶液抑制内源性过氧化物酶，5% BSA封闭30 min，Bax和Bcl-2的 I 抗浓度均为 1∶200，常规设立阴性对照(用PBS代替 I 抗)，于4 ℃冰箱过夜。滴加1∶1 000稀释的 II 抗，置于37 ℃恒温箱孵育2 h。PBS洗去未结合抗体，DAB显色，中性树胶封片，阳性结果为棕黄色颗粒沉积。

2.3 Bcl-2和Bax免疫荧光染色 4%多聚甲醛4 ℃固定，Triton X-100静置15 min后，5% BSA室温封闭15 min，滴加1∶200稀释的Bax I 抗，4 ℃过夜。PBS 洗去未结合抗体(5 min×3次)，避光滴加1∶300稀释的荧光 II 抗，黑色湿盒内37 ℃孵育1 h。Hoechst 复染1 min，PBS清洗 5 min×3次，滴加抗荧光淬灭剂并封片，荧光显微镜下拍片。染色结果Hoechst为蓝色，以此定位肌细胞核；FITC荧光 II抗呈绿色，标记Bcl-2和Bax蛋白，随机选取3个高倍视野(×400)，采用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件，统计任意单位内平均荧光强度。

2.4 Western blot 收集不同批次成肌细胞，加裂解液后刮取蛋白液，离心取上清，采用考马斯亮蓝测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE 分离蛋白后电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1.5 h，TBST洗去脱脂奶粉(7 min×3次)，兔单克隆Bcl-2、Bax抗体及鼠单克隆PCNA抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜7 min×3次，HRP标记IgG II 抗(1∶5 000)室温孵育1 h，最后加入BeyoECL Plus显色液于凝胶成像仪器曝光。GAPDH作为内参照，实验重复3 次。运用Quantity One凝胶图像分析系统对结果进行灰度分析，以相对值定量表达各蛋白。

3 统计学处理

应用SPSS 19.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组织化学检测各组成肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达

免疫组织化学检测结果显示：Bcl-2和Bax免疫阳性产物为棕黄色颗粒，主要位于胞浆。正常对照组及单纯bFGF组成肌细胞胞质内含有大量Bcl-2阳性颗粒，少数细胞为Bax阳性表达；氧化应激组Bcl-2阳性颗粒锐减，Bax阳性细胞数量增加；bFGF干预后，Bcl-2阳性细胞增多，Bax表达随之减少，见图1、表1。

2 成肌细胞Bcl-2和Bax免疫荧光表达情况

正常成肌细胞形态为梭形或成纤维样，细胞生长速度较快，Bax荧光强度低，Bcl-2荧光强。应激组肌细胞Bax荧光表达呈强阳性，细胞体积变小，胞质收缩明显，细胞突起变短或消失。bFGF干预后，成肌细胞Bax阳性蛋白表达显著减少，Bcl-2蛋白表达增加，见图2、表2。

Figure 1.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (×200).

图1 各组成肌细胞Bcl-2和Bax蛋白免疫组化结果

表1 各组成肌细胞Bcl-2和Bax免疫组化结果

Table 1.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.041.00±0.13bFGF1.05±0.161.16±0.14H2O2 0.35±0.12** 2.27±0.23**bFGF+H2O20.86±0.05##1.14±0.10##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

3 Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白的表达水平

正常对照组及单纯bFGF组Bax蛋白呈现低水平表达，Bcl-2和PCNA蛋白水平较高。氧化应激组成肌细胞Bax蛋白表达显著增加，同时PCNA和Bcl-2蛋白水平降低。给予bFGF干预后，Bcl-2和PCNA表达增加，Bax蛋白水平下调，见图3、表3。

讨 论

压疮深部组织损伤为压疮中组织严重损伤类型，其发生隐匿、后期极易进展为难愈性创面。近年来研究显示，缺血再灌注生成氧自由基致使肌组织继发性损伤为DTI关键所在[9]。过氧化氢是机体细胞氧化应激主要成分之一，目前已应用于体外DTI相关研究[10-11]。本实验基于前期结果[5]，以100 μmol/L叔丁基过氧化氢作用4 h为氧化应激组，在此基础上探讨bFGF对大鼠成肌细胞Bcl-2、PCNA等蛋白影响。

Figure 2.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunofluorescence (×400).

图2 各组成肌细胞Bcl-2和Bax蛋白免疫荧光检测结果

表2 各组成肌细胞Bcl-2和Bax荧光表达情况

Table 2.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunofluorescence (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.141.00±0.07bFGF0.97±0.031.07±0.06H2O20.40±0.04**1.51±0.16**bFGF+H2O20.70±0.13##0.82±0.02##

**P<0.01vscontrol;##P< 0.01vsH2O2.

Figure 3.The protein levels of Bcl-2, Bax and PCNA in the rat myoblasts detected by Western blot.

图3 成肌细胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表达

研究表明，Bcl-2家族蛋白在压疮早期肌肉组织受损中具有重要作用，随着Bcl-2/Bax比值的降低，组织损伤逐渐加重[12]。本实验氧化应激组Bax水平上升而Bcl-2蛋白呈下降趋势，这与张恩等[13]在III期压疮溃疡创面中发现Bax蛋白增加，Bcl-2减少结果一致。在对氧化应激组成肌细胞应用bFGF进行干预后，Bcl-2表达增加明显，Bax水平下降，提示bFGF上调Bcl-2/Bax比值有助于降低成肌细胞损伤，然而损伤减轻也有可能与bFGF上调细胞损伤耐受阈或是成肌细胞本身增殖活性增高相关。

PCNA是一种分子量为36 kD的细胞核蛋白，在细胞周期中同DNA合成一致，为细胞从G0、G1期进入S期的前提[14]。PCNA在各种损伤中常存在表达下降现象，而损伤恢复期伴随该指标的增加。bFGF是一种广谱促有丝分裂的生长因子[15]。在小型猪全层皮肤缺损创面的研究中，陈涛等[16]发现bFGF可通过上调PCNA表达刺激 DNA合成，促进上皮细胞增殖与迁移，加速创面修复。传统观念中骨骼肌为已分化组织，不具备再生能力，近年来在肌组织基底膜内发现存在着具有增殖活性的成肌细胞，在烧伤应激等损伤恢复过程中通过PCNA结合细胞微观检测发现成肌细胞能够增殖融入肌纤维内，以维持肌组织体积与功能的稳定[17]。本实验氧化应激组成肌细胞PCNA含量处于较低水平，这可能与氧自由基攻击位于核小体中组蛋白成分，造成DNA损伤后引起成肌细胞损伤增加有关，同时氧化应激本身可破坏成肌细胞的微环境。王雅一等[18]报道PCNA可与蛋白因子结合参与细胞周期调控、DNA修复以及细胞损伤等过程。通过外源性bFGF的干预，本实验发现bFGF可上调成肌细胞PCNA和Bcl-2表达，这可能与外源性bFGF结合成肌细胞膜表面受体，通过转入具有增殖活性的细胞核内，发挥生物学功能有关。

表3 各组成肌细胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表达水平

*P<0.01vscontrol;#P<0.01vsH2O2.

综上所述，本实验发现bFGF能够减少氧化应激过程中成肌细胞Bax蛋白水平，同时增加Bcl-2、PCNA表达，为bFGF在压疮深部组织损伤的治疗提供了一定的实验基础与新思路。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effect of Bcl-2 and PCNA expression in rat myoblast injury induced by hydrogen peroxide

MAO Ting-ting1, ZHENG Ya-hua1, FANG Hong-bo2, XIE Lu-ji1, ZHANG Wei-dan1, JIANG Li-ping2

(1NingboMedicalCenterLihuiliEasternHospital,Ningbo325000,China;2XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:lipingj@shsmu.edu.cn)

AIM: To explore the role of Bcl-2 and PCNA expression in the injury of rat myoblasts induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: Rat myoblasts at growth phase were divided into 4 groups based on basic fibroblast growth factor (bFGF) and H2O2levels: normal control group, bFGF group, model group (H2O2group) and treatment group (bFGF+H2O2group). The expression of Bcl-2 and Bax was observed by immunohistochemistry and fluorescence methods. The protein levels of Bax, Bcl-2 and PCNA were determined by Western blot. RESULTS: Compared with model group, both immunofuorescence and fluorescence in treatment group showed enhanced Bcl-2 and low expression of Bax. Furthermore, the results of Western blot showed up-regulated PCNA and Bcl-2 protein and decreased Bax expression in treatment group.CONCLUSION: Oxidative stress results in the pathologic changes of myoblasts, and the up-regulation of Bcl-2 and PCNA may attenuate myoblast injury.

Deep tissue injury; Oxidative stress; L6 myoblasts; Basic fibroblast growth factor

1000- 4718(2017)05- 0935- 05

2016- 08- 11

2017- 02- 08

国家自然科学基金资助项目(No. 81372064); 上海市教委护理高原学科建设资助项目

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.028

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13868311990； E-mail: lipingj@shsmu.edu.cn