白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路相关分子表达的影响

唐志铭，丁继存，翟晓翔，荆梦晴，李永聪

（1.江苏省徐州市中医院，徐州221003；2.江苏省徐州市中心医院，徐州221009）

·论著·

白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路相关分子表达的影响

唐志铭1，丁继存2，翟晓翔1，荆梦晴1，李永聪1

（1.江苏省徐州市中医院，徐州221003；2.江苏省徐州市中心医院，徐州221009）

目的观察白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路关键分子PI3K、Akt、mTOR表达的影响。方法应用免疫荧光检测PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达；病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度白藜芦醇处理后，分别应用RT-PCR、Western Blot检测PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的表达。结果免疫荧光检测结果显示，PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达明显增强，且主要表达于细胞核，而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达；RT-PCR及Western Blot检测结果显示，病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度的Res干预后，Akt和mTOR mRNA和蛋白表达量降低，并且呈剂量依赖关系，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），而PI3K mRNA和蛋白表达量降低不明显，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论白藜芦醇抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制可能与其下调mTOR信号通路关键分子Akt、mTOR表达有关。

白藜芦醇；病理性瘢痕；成纤维细胞；mTOR信号通路

白藜芦醇（Resveratrol，Res）是一种存在于虎杖、藜芦、决明等中草药植物中的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、改善微循环、保护线粒体功能等多种生物学活性及药理作用[1]。目前Res在肿瘤方面的研究较多，现已证实其对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用[2]。此外，本课题组研究证实Res还具有抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的作用[3]，但具体机制尚未完全阐明。病理性瘢痕具有类肿瘤特性，许多肿瘤相关基因参与其形成过程，而Res能抑制多种肿瘤细胞的增殖，这提示笔者借鉴肿瘤的有关研究成果来探讨Res抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制将具有重要的意义。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路与细胞异常增殖及肿瘤的发生密切相关，mTOR基因在多种肿瘤组织中表达明显增强[4]。因此，笔者推测在病理性瘢痕成纤维细胞增殖过程中mTOR信号通路可能具有重要的作用，且Res对该信号通路可能存在干预作用。为证实这一推测，本研究应用细胞免疫荧光、RTPCR、Western Blot等技术检测mTOR信号通路相关分子在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达情况，并进一步探讨Res对该通路的干预作用，以期阐明Res抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂Res（西安冠宇生物技术有限公司）、0.25%胰蛋白酶（上海拜力生物科技有限公司）、胎牛血清（上海拜力生物科技有限公司）、Triton X-100（上海联硕生物科技有限公司）、D-Hank’s液（上海康朗生物科技有限公司）、反转录试剂盒superscriptⅢ（美国Invitrogen公司）、兔抗人mTOR单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗人PI3K单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗人Akt单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海索莱宝生物科技有限公司）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG二抗（Jackson免疫研究公司）

1.1.2 主要仪器PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)、电泳仪（北京六一）、高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）、CO2培养箱（日本三洋）、荧光显微镜及数字CCD成像装置（日本奥林巴斯）、Quantityone凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）、红外荧光成像仪（美国LI-COR公司）、Image Pro-Plus图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.1.3 标本来源标本来自徐州市中医院皮肤科手术切除治疗后的前胸部病理性瘢痕组织和徐州市中医院泌尿外科包皮过长患者所切除的的正常皮肤组织。

1.2 方法

1.2.1 成纤维细胞分离、培养无菌条件下切取正常皮肤组织及病理性瘢痕组织标本，用眼科剪仔细剔除上皮及皮下组织，D-Hank’s液洗3遍，然后剪成1 mm3大小的组织块，置于1个无菌瓶中。无菌瓶中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液5 mL，封口、摇匀，4℃冰箱冷消化14 h；再置于37℃培养箱中孵育15 min，若组织稀疏，边缘变毛，用200目筛网过滤，收集滤液，其余可以继续消化；将滤液离心，1 000转/min，7 min，弃上清液；用含10%胎牛血清的DMEM液5 mL混匀沉淀细胞，置于1个25 mL的培养瓶中；在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中静置培养48h后，用含10%胎牛血清的DMEM换液，镜下观察细胞生长情况。细胞接近长满时，按1∶3比例进行传代。本实验选用第5代细胞。

1.2.2 病理性瘢痕成纤维细胞分组与干预方法Res DMEM培养基配制：取Res 20 mg，加入含10%胎牛血清、100 U/L的青、链霉素的DMEM培养基10 mL，轻摇振荡，待全部溶解后，使用0.2 μm一次性针式过滤器过滤除菌，然后再用DMEM高糖溶液分别稀释至0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L。

分组与干预方法：取第5代病理性瘢痕成纤维细胞接种在96孔培养板中，分为3个Res浓度组（即0.1 g/L浓度组、0.5 g/L浓度组、1.0 g/L浓度组，浓度筛选根据预实验中细胞半数抑制浓度1/3～2/3范围时的Res浓度得出）和1个对照组，每组24个培养孔。用含10%胎牛血清的DMEM液将第5代成纤维细胞配成单个细胞悬液，以1.0×104/mL的密度接种于96孔培养板中，200 μL/孔，置于CO2培养箱中常规培养。细胞贴壁后，吸去培养板孔内旧培养液，再每孔加入不含胎牛血清DMEM液180 μL，然后3个实验组分别加入相应浓度的Res 20 μL。对照组则加入含10%胎牛血清的DMEM液20 μL。

1.2.3 免疫荧光检测PI3K、Akt、mTOR在成纤维细胞中的表达取第5代培养的成纤维细胞，加入4%多聚甲醛室温下固定30 min，用PBS缓冲液洗涤3次，0.1%Triton X-100 37℃孵育20 min，PBS洗涤，非免疫山羊血清封闭1 h，吸净血清后加入一抗，4℃孵育过夜，次日PBS冲洗后，加入二抗（1∶200），37℃孵育60 min，PBS冲洗，DAPI避光复染，10 min后荧光显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR检测病理性瘢痕成纤维细胞中PI3K、Akt、mTORmRNA的表达细胞培养及干预方法如前，标准环境下孵育24 h后,采用Trizol Reagent总RNA提取试剂盒进行总RNA提取，操作步骤按试剂盒说明书进行。电泳鉴定提取RNA的完整性。经测定，所有样本A260/A280（RNA在260 nm处的吸光值与在280 nm处的吸光值的比值）均大于1.8，提示样本纯度较高，无明显蛋白污染。统一调整总RNA纯度为0.5 g/L，于－70℃储存。

取6 μL RNA为反转录模板。反转录反应体系为20 μL，反应条件：37℃1 h，95℃3 min。标准曲线定量法制备cDNA模板标准品，依次10倍梯度稀释，制备成5个梯度的cDNA模板定量标准品。在GenBank数据库中获得目的基因mRNA序列，采用Primer Express 2.0软件，在CDS区设计特异性引物。引物序列见表1。

表1 PI3K、Akt、mTOR基因引物序列及扩增产物片段长度

PCR反应体系为50 μL，反应条件：93℃预变性3 min，93℃变性30 s，57℃退火30 s，共循环30次，72℃延伸5 min。取6 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用Quantity-one凝胶成像分析系统分析各条带的灰度值，以各目的基因与内参基因βaction的灰度值比值表示mRNA的相对表达量（RQ）。基因的表达量RQ=2-△△Ct。RQ值越大表示基因表达量越高。

△△Ct计算方法：△△Ct=（待测样品的目的基因的Ct的平均值－待测样本的看家基因的Ct平均值）－（对照样品的目的基因的Ct平均值－对照样本的看家基因的Ct平均值）。

1.2.5 Western Blot检测病理性瘢痕成纤维细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达细胞培养及干预方法同前。收集培养的病理性瘢痕成纤维细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗2次，加入细胞裂解液，在冰面上静置10～20 min，用细胞刮匀浆后，4℃下15 000 r/min离心10 min，取上清。用Lowry法对上清进行蛋白定量，取50 μg蛋白上样到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。待溴酚蓝进入凝胶底部后，将蛋白质再印迹到硝酸纤维素膜上，加入一抗4℃孵育过夜，最后加人用辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗，室温孵育1 h，洗膜后，Odyssey红外荧光成像仪扫描膜并成像,成像图用Image Pro-Plus图像分析系统进行分析。

2 结果

2.1 免疫荧光结果细胞免疫荧光检测结果显示，PI3K标记为红色见图1a，DAPI标记细胞核为蓝色荧光见图1b，图1a和图1b融合后发生重叠见图1ab，表明PI3K表达在细胞核，而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达见图1A、B、AB。细胞免疫荧光检测结果显示，Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达于细胞核见图2、3，a、b、ab，而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达见图2、3，A、B、AB。

图1 PI3K在成纤维细胞中的表达

图2 Akt在成纤维细胞中的表达

图3 mTOR在成纤维细胞中的表达

2.2 RT-PCR检测PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达病理性瘢痕成纤维细胞经0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L的Res干预后，其PI3K mRNA相对表达量与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而Akt、mTOR mRNA相对表达量降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。Pearson法进行相关性分析表明，Akt、mTOR mRNA的相对表达量与Res干预浓度呈负相关（r=-0.763，P＝0．02；r＝－0．854，P＝0．03）。

表2 PI3K、Akt、mTOR mRNA相对表达量

2.3 Western Blot检测PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达病理性瘢痕成纤维细胞经Res干预后，Akt、mTOR各浓度组蛋白条带比对照组明显减弱，而PI3K各浓度组减弱不明显，见图4。

图4 PI3K、Akt、mTOR蛋白表达电泳图

Image Pro-Plus图像分析系统分析显示，Akt、mTOR各浓度组蛋白相对表达量均降低，与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），而PI3K各浓度组蛋白相对表达量降低不明显，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。Pearson法进行相关性分析表明，Akt、mTOR蛋白相对表达量与Res干预浓度呈负相关（r=-0.683，P=0.02；r=-0.897，P=0.01）。

表3 PI3K、Akt、mTOR mRNA蛋白相对表达量

3 讨论

病理性瘢痕是一种以真皮成纤维细胞大量增殖和胶原纤维过度沉积为主要病理特征的增生性疾病。本病常发生在外伤、烧伤及外科手术后，增生的纤维组织明显高于周围正常皮肤，不仅影响美观，甚至可因瘢痕挛缩而造成严重的功能障碍[5]，给患者身心健康带来严重危害。因此，病理性瘢痕的防治在皮肤外科及烧伤整形科领域是一项重要课题。目前病理性瘢痕形成的具体机制尚不十分清楚，其防治也没有取得突破性进展。所以，对病理性瘢痕的发病机制进行深入研究，并寻找安全有效的治疗手段将具有重要的意义。中医药防治瘢痕有着悠久的历史，许多宝贵的经验与方法值得进一步深入挖掘。

Res是一种存在于虎杖、藜芦、决明等中草药植物中的多酚类化合物，具有多种生物学活性及药理作用。目前Res在肿瘤方面的研究较多，现已证实其对胰腺癌[6]、宫颈癌[7]、表皮样癌[8]等多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。此外，本课题组研究证实Res还能够抑制病理性瘢痕组织成纤维细胞的增殖，但其具体机制尚不十分清楚，因此值得进一步探索。病理性瘢痕属于良性实体瘤，具有类肿瘤特性[9]，尤其是瘢痕疙瘩可向周围正常组织呈侵袭性生长，其病理特点与肿瘤极为相似。目前有研究证实许多肿瘤相关基因也参与了病理性瘢痕的形成过程[10-11]，一些治疗肿瘤的方法和药物对病理性瘢痕亦有效[12]，而Res能抑制多种肿瘤细胞的增殖，这提示借鉴肿瘤的有关研究成果来探讨Res抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制将具有重要的意义。

mTOR信号通路是调控蛋白质合成的主要信号通路,参与细胞增殖、分化等调节，受到有关研究者的日益重视，逐渐成为研究的热点，尤其是在肿瘤方面的研究日渐深入。目前有研究表明mTOR信号通路与肿瘤的发生密切相关，mTOR基因在在多种肿瘤，如肺癌[13]、子宫内膜癌[14]、大肠癌[15]等组织中表达明显增强。如前所述，病理性瘢痕具有类肿瘤特性，Res能抑制多种肿瘤细胞的增殖，因此，笔者推测在病理性瘢痕成纤维细胞增殖过程中mTOR信号通路可能具有重要的作用，且Res对该信号通路可能存在干预作用。为证实这一科研假说，本研究应用细胞免疫荧光、RT-PCR、Western Blot等技术来探讨mTOR信号通路关键分子PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达情况及Res的调控作用。

细胞免疫荧光检测结果显示，PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达明显增强，且主要表达于细胞核，而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达。RT-PCR及Western Blot检测结果显示，病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度的Res干预后，PI3K mRNA和蛋白相对表达量与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而Akt、mTOR mRNA和蛋白相对表达量均降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson法进行相关性分析表明，Akt、mTOR mRNA和蛋白相对表达量与Res干预浓度呈负相关。这表明Res抑制Akt、mTOR的表达有一定的剂量依赖性，即随着Res浓度的增加而抑制作用增强。以上研究结果表明，mTOR通路参与了病理性瘢痕的形成过程，而Res对该信号通路存在干预作用。Res干预病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制可能与其下调mTOR信号通路关键分子Akt、mTOR表达有关，这为后续开发利用Res治疗病理性瘢痕提供了理论依据。

[1]赵克森.白藜芦醇的生物学特性和效应[J].中国病理生理杂志, 2012,28（9）:1709-1711.

[2]熊小春,安舂妹.白藜芦醇抗肿瘤的研究进展[J].黑龙江医药, 2010,23（1）:59-61.

[3]丁继存,翟晓翔,唐志铭.白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞及TGF-1/Smads信号通路的影响[J].河北医科大学学报,2014,35（1）:37-41.

[4]Steelman LS,Chappell WH,Abrams SL,et al.Roles of the Raf/ MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathways in controlling growth and sensitivity to therapy-implications for cancer and aging [J].Aging（Albany NY）,2011,3:192-222.

[5]Bloemen MC,van der Veer WM,Ulrich MM,et al.Prevention and curative management of hypertrophic scar formation[J].Burns, 2009,35:463-475.

[6]秦勇,马清涌,党晓燕,等.白藜芦醇对胰腺癌Miapaca-2细胞侵袭转移能力影响的体外观察[J].西安交通大学学报:医学版, 2014,35（1）:64-68.

[7]洪华容,陈靓,姚中凯,等.白藜芦醇对宫颈鳞癌原代细胞增殖及荷瘤小鼠成瘤的影响[J].徐州医学院学报,2013,33（9）:583-587.

[8]翟晓翔,姜月华,严月华,等.白黎芦醇对人表皮样癌细胞端粒酶活性及其增值、凋亡的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2011,10（5）:276-279.

[9]宗宪磊,姜笃银,蔡景龙,等.瘢痕疙瘩的肿瘤特性研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2007,18（5）:393-396.

[10]冷冰,韩思源,王玉新,等.p53基因在病理性瘢痕中的表达及意义[J].中国美容整形外科杂志,2011,22（2）:120-123.

[11]卓阳,曾兴业,周雪雪,等.瘢痕疙瘩发病风险与Fas基因-670位点多态性[J].中国美容医学,2008,17（3）:393-395.

[12]Kleinerman R,Kilmer SL,Cbotzen VA.Mitomycin C in the treatment of keloids:a case and review[J].J Drugs Dermatol,2013, 12:701-703.

[13]张星星,童佳兵,杨程,等.芪玉三龙汤对肺癌移植瘤小鼠PI3K/ Akt/mTOR通路PI3K、Akt、mTOR表达的影响[J].安徽中医药大学学报,2016,35（1）:73-77.

[14]徐浩.p-Akt、p-mTOR在子宫内膜腺癌中的表达及意义[J].齐齐哈尔医学院学报,2013,34（21）:3145-3146.

[15]汪砥,陈健,陈辉,等.瘦素与p-mTOR在大肠癌中的表达及临床意义[J].中南大学学报:医学版,2012,37（3）:233-237.

Effects of Resveratrol on Expression of Molecules Related with mTOR Signaling Pathway in Pathological Sar Fibroblasts

Tang Zhiming1,Ding Jicun2,Zhai Xiaoxiang1,Jing Mengqing1,Li Yongcong1
1.Traditional Chinese Medicine Hospital of Xuzhou City,Xuzhou 221003,China;2.Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221009, China

ObjectiveIn order to observe the effects of resveratrol on expression of molecules such as PI3K,Akt and mTOR related with mTOR signaling pathway in pathological scar fibroblasts.MethodsThe expression of PI3K,Akt and mTOR in pathological scar and normal skin fibroblasts were detected by immunofluorescence.After treated with different concentrations of resveratrol,the expression of PI3K,Akt and mTOR mRNA and protein were respectively detected by RT-PCR and Western Blot.ResultsImmunofluorescence showed that the expression of PI3K,Akt and mTOR were significantly enhanced in pathological scar fibroblasts,and mainly expressed in the nucleus,but no expression in normal skin fibroblasts.RT-PCR and Western Blot test results showed that after treated with different concentrations of resveratrol,the mRNA and protein expression of the Akt,and mTOR were decreased in a dose dependent manner.Compared with the control group,the difference was statistically significant（P<0.05）.But PI3K mRNA and protein expression was not significantly reduced,and it has no significant difference compared with the control group（P>0.05）.ConclusionThe mechanism of resveratrol inhibiting pathological scar fibroblast proliferation may be associated with reducing the expression of mTOR signaling pathway key molecule Akt and mTOR.

Resveratrol;Pathological sca;Fibroblasts;mTOR signaling pathway

R619.6

A

1672－0709（2017）02-0103－05

2016-6-12）

江苏省第4期“333高层次人才培养工程”科研项目（BRA2014053）；徐州市科技计划项目（KC14SH037）；本项目得到徐州市医学青年后备人才项目专项资金资助

丁继存，E-mail:djicun@126.com