医学超声造影研究现状与进展

余后强, 何晓玲, 丁明跃＊

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074；2.中国地质大学(武汉)校医院，武汉 430074）

医学超声造影研究现状与进展

余后强1, 何晓玲2, 丁明跃1＊

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074；2.中国地质大学(武汉)校医院，武汉 430074）

丁明跃，男，博士，华中科技大学生命科学与技术学院教授，教育部跨世纪优秀人才。现任华中科技大学生命科学与技术学院院长助理、生物医学工程系常务副主任，教授、博士生导师。近年来共承担完成国家973，国家自然科学基金，国家高技术863，国家支撑计划，国家重大科学仪器开发专项，科技部重大国际合作专项，教育部博士点重点专项基金，湖北省自然科学基金重点项目等三十余项。已编辑出版中英著作八部，在国内外权威期刊以及国际会议上发表论文400余篇，其中被SCI收录50余篇，EI收录300篇，ISTP收录100篇。获欧洲专利一项，中国发明专利二十余项，计算机著作登记权五项，美国专一项。先后获得德国洪堡基金，加拿大青年创新奖等国内外奖励20余项。

医学超声造影是一种能显著增强医学超声检测信号的新的医学超声成像方式。本文从造影剂的产生﹑发展﹑结构特点及应用领域等进行了简要的叙述，重点介绍了针对造影剂的信号分析，成像方法，纳米级造影剂的研究进展及临床应用前景，为人们全面了解超声造影技术提供了参考与借鉴。

超声造影剂；成像方法；纳米；靶向

引言

在当前临床诊断中，超声成像已成为一种应用最为普遍的医学影像技术。与其他成像方式相比，超声能够提供软组织结构和血流无创实时的横截面图像。然而，由于血液对超声信号的反射性差，使用常规多普勒超声检测血管或较深部位组织中的血流时往往图像分辨率差，难以把正常组织和病变组织区分开来[1]。为了解决这个问题，提高诊断的准确性，人们发明了超声造影剂(Ultrasound Contrast Agent, UCA)。UCA的产生可追溯到1968年，当时，罗彻斯特大学的Gramiak和Shah在为一名患者进行心脏超声检查时，偶然发现将一种含靛青蓝绿染料的生理盐水注射到患者体内后，在心腔内短暂看到一团云雾状声影[2]。分析原因是由于血液是低回声的超声信号散射体，在回波图像中保持黑暗，而注射的盐水中含有大量的微小气泡，它们和血液中红细胞的声阻抗不同，从而产生了很强的回波信号，使得主动脉壁和血流之间的对比度得到显著提高。

从UCA的出现到今天已有近50年历史，它的组成和作用发生了很大变化，其发展历程大致可分成四个阶段[3]：（1）第一阶段UCA粒径较大且不稳定，因为它的表面无包膜，内部填充空气或氧气，当进入血液后，很容易在气芯和周围液体产生的表面张力作用下破裂。同时，由于直径大，不能通过肺毛细血管进行血液循环，需要通过插入心导管的方式进入主动脉和心腔进行右心造影，对患者造成了很大创伤[4]；（2）第二阶段UCA主要是在表面包裹了白蛋白﹑脂类或多糖等物质，以增加其稳定性，内部填充气体主要是空气[5]。这个阶段出现了在临床上获得使用许可的产品。1994年，第一个获得上市批准的造影剂Albunex在美国出现[6]，它是由美国Molecular Biosystems公司开发。Albunex由白蛋白包裹，可在以空气为核的表面形成弹性固体外壳，通过抵消液体的表面张力提高气泡的稳定性。随后上市的是德国Bayer公司的Levovist，1996年分别获得了欧洲和日本的批准。Levovist外壳由半乳糖和棕榈酸组成，当浸入液体时有较好的稳定性；（3）第三阶段UCA致力于继续研究如何提高UCA的稳定性和有效性。这时的造影剂不再以空气为核心，代之以高分子气体或惰性气体（如全氟化碳C3F8﹑六氟化硫SF6等），包膜材料主要为白蛋白或磷脂。这个时期的主要代表为GE公司的Optison，Lantheus公司的Definity以及意大利Bracco公司的SonoVue。SonoVue也是目前唯一获得批准在我国上市的UCA，其外壳主要为磷脂，内部包裹SF6。与第二代UCA相比，这一阶段的造影剂因为有相对柔性的外壳和稳定的气体核心，在散射超声信号上更高效，也更稳定，在临床上获得了广泛的应用。目前在世界范围内获得批准上市的主要造影剂及相关信息如表1所示。这些商用造影剂均为微米级的，粒径在1-10微米之间，通过静脉注射进入人体后，能顺利通过肺循环，但不能透过血管壁，只能进行所谓的血池成像。因此，具有更小尺寸和对病变部位有靶向能力的纳米级UCA就成为了研究的热点，这也是UCA发展的第四个阶段。目前虽然取得了一些成果，但离临床应用还有较大的距离，尚处于实验室阶段。

表1 临床上获得使用许可的UCA

1 基于UCA的造影谐波成像方法研究

由于UCA拥有气态的内核和柔软的外壳，当进入血液或组织时有较高的可压缩性，当超声作用到这些微泡时，在声压作用下可引起体积的变化，产生很强的反射回波[7]。很长一段时间以来，人们都认为微泡在声压作用下体积变化是线性的，反射信号与发射信号的频率相同。直到20世纪90年代中期，有学者研究发现，当超声波能量较高时，微泡的体积变化是非线性的，产生的回波中除了基波外，还有大量的谐波，并将基波频率的2倍﹑3倍﹑4倍等称为高谐波，将1/2﹑1/3倍基波频率的信号称为次谐波，将高于基频的分数次谐波，如3/2﹑4/3倍的谐波称之为超谐波。在这些不同的谐波中，二次谐波的信号最强[8]。由于人体组织在超声作用下也会产生谐波信号，并与造影剂产生的谐波信号混杂在一起，如何将这两种信号区分开来，就成为提高造影成像质量的关键。目前在临床超声机上普遍使用的一种方法是脉冲反相谐波技术[9]，该方法是让超声探头发射两束振幅相同﹑相位相反的脉冲，经过组织和微泡反射后，组织产生的线性回波由于振幅相同﹑相位相反，叠加后抵消掉了。而微泡产生的谐波中，奇次项部分抵消，偶次项会相加，因此二次谐波信号会变得更强，其原理如图1所示。与谐波成像相比，脉冲反相谐波成像方法能够获得更好的图像分辨率。

另外，次谐波成像也引起了很多学者的注意，相比二次谐波，次谐波有其自身的优点[10]：（1）组织不会产生次谐波，因此不用考虑组织谐波信号的影响；（2）次谐波比二次谐波频率低，因而具有更大的探测深度，适合于深部组织的扫描；（3）次谐波成像所采用的发射频率较高，因此可有效地减少空化效应的发生。目前对次谐波的研究主要集中于信号的产生和应用两方面。Shankar等通过理论分析和实验结果得出当超声探头的发射频率是微泡共振频率的两倍时，产生的次谐波信号最强[11]。Elena Biagi等研究发现，发射脉冲的波形也会影响次谐波的产生[12]。从Shi[13]开始，很多学者研究了商业造影剂，如Levovist﹑Optison﹑Definity﹑SonoVue﹑Sonazoid等次谐波产生与声压及环境压力的关系[14,15]，这些结果显示次谐波的产生可分为三个阶段：发生期﹑增长期和饱和期。发生期的次谐波信号很微弱，远远小于二次谐波，不适合用于成像。增长期的信号随声压的增加而增大，此时可用于成像。随着声压继续增加，次谐波达到了一个饱和状态，但由于此时声压太大，微泡容易破裂，造成噪声水平上升，图像信噪比降低。此外，研究还发现，次谐波信号的幅度与环境压力之间有密切的关系。根据这些特征，人们将其主要应用于心脏﹑肝脏和心脑血管等疾病诊断中。如Forsberg使用Sonazoid产生的次谐波信号无创性地定量评估了左心室压力，相比于目前临床上使用的侵入式导管术进行评估，该方法伤害小，评估效果好[16]。Dahibawkar将Definity产生的次谐波信号用于裸鼠乳腺癌模型中新生血管的成像[17]。Forsberg还将Definity产生的次谐波信号用于乳腺癌血管的三维重建[18]。

图1 脉冲反相谐波技术成像示意图[9]

对于超谐波成像，人们也开展了大量的成像研究。南京大学的章东等通过对超谐波声场的理论和实验研究证明了超谐波成像的可行性[19]。荷兰Erasmus大学的Nico De Jong等利用SonoVue产生的超谐波信号进行成像，取得了非常好的效果。使用专门设计的针对超谐波成像的探头，通过计算CTR(造影剂对组织比），获得比二次谐波高40dB的信号增强[20]。在超谐波的应用方面，也有很多学者进行了研究。比如西班牙San Carlos医院的Macaya利用Levovist产生的超谐波信号定量评估了心肌灌注[21]，Nico De Jong使用Definity产生的超谐波对鸡胚胎中的微血管进行了成像[22]。

目前对于造影剂的成像方法还处于不断的研究与探索之中，因此，这些谐波成像方法不仅提高了造影谐波成像的质量，而且进一步拓展了造影剂的使用范围和应用领域。

2 UCA的应用

临床上大范围使用UCA是从第二阶段开始，最初主要用于心脏类疾病的研究，如心肌声学造影﹑评价瓣膜狭窄及关闭不全﹑心腔心内膜显影﹑诊断先天性心脏病等，近年来已广泛应用于许多疾病中，如通过检测乳腺﹑子宫﹑卵巢等器官的肿瘤血供情况，帮助医生更准确的鉴别良恶性。对于一些非血管的区域如胃﹑尿道﹑输卵管等也有使用。总的来说，UCA的临床应用主要集中在三个方面：微血管灌注成像﹑分子成像﹑靶向治疗。

当UCA通过静脉注射进入人体后，在血液循环的作用下分布到全身。相比于传统的检测血流的超声多普勒成像，利用造影剂可以更加灵敏全面地反映血流灌注信息，如微血管的血量﹑血液速度﹑微血管密度等[23]，这些对于诊断糖尿病﹑高脂血症﹑冠状动脉等疾病都有很大的帮助。通过肿瘤部位的微血管灌注成像和造影增强程度的研究，可大大提高对肿瘤内小血管的检出率及良恶性的鉴别正确率。此外，通过定量分析造影剂含量与时间的关系，还可以更好地区分正常组织和病变组织。

图2 超声分子成像用途图解[25]

UCA的发展使得超声成像能够达到分子成像的水平。所谓分子成像，是指在细胞或分子水平上识别组织生理病理变化的一种成像模式[24,25]。目前常见的分子成像方法有磁共振成像﹑核医学分子成像﹑光学成像﹑超声分子成像等。由于具有实时﹑无创﹑高敏感性等优点，超声分子成像近年来成为人们研究的热点，已被广泛应用在临床诊断的许多方面，如图2所示。超声分子成像一般要借助于造影剂产生的回波信号进行成像。为了让造影剂能够在指定目标点处聚集，通常有两种方法：主动靶向和被动靶向。主动靶向（active targeting）是通过在造影剂表面连接特异性的靶向物（如配体﹑抗体等）去获得对目标位置的主动聚集和滞留。许多学者对此进行了研究，如Pochon设计了一种外壳偶联VEGFR2抗体的微泡造影剂BR55，用于原位大鼠乳腺癌模型的分子成像中[26]。国内学者郑海荣等将多肽iRGD共价连接到微泡上，对肿瘤新生血管进行了分子成像[27]。相比主动靶向，被动靶向（passive targeting）则根据造影剂的物理化学性质（如表面结构﹑携带电荷或包膜组成等）使其被某些细胞或组织吸附或吞噬，达到留在目标位置进行特异性分子成像的目的，如炎症内皮细胞对白蛋白类包膜微泡的吸附。

此外，UCA还可作为一种载体，进行药物的靶向传输和治疗。在造影剂的表面同时连上靶向物和药物，当造影剂在主动靶向的作用下进入目标组织后，其上携带的药物在一定的作用下释放出来，达到治疗的目的。

3 纳米级UCA研究进展

在过去的20多年中，微泡造影剂作为一种辅助工具极大帮助了医生利用超声波去探查疾病。目前临床上使用的UCA都为微米级的，可以增强血池内回波的信号，对血供丰富的器官或组织有较好的成像效果，属于血池造影剂。由于血管内皮细胞间隙为380-780纳米，微米级的造影剂无法穿透这些间隙进行成像，因此限制了对血管外病变组织的探查能力。近年来，纳米技术与分子生物学的快速发展有力促进了纳米级造影剂的研究，使得在一些疾病特别是肿瘤的分子成像和靶向治疗中成为了可能。

图3 纳米造影剂对肿瘤组织显影的原理[28]

3.1 纳米级UCA成像原理

相比于微泡造影剂较大的散射横截面，纳米级造影剂粒径更小，对超声信号的反射更低，在图像上表现为低回声。只有当大量聚集到病灶部位，才能产生较强的回波信号，属于聚集成像。纳米造影剂的这些特征高度符合肿瘤分子成像的要求，即要在肿瘤部位得到显著增强，而背景噪声又很低。如果将纳米造影剂的粒径控制在700纳米以下，就可以穿透血管内皮间隙，完成血管外病灶组织的显影成像，其成像原理如图3所示[28]。为了取得好的成像效果，很多学者在这方面进行了研究。如Yin[29]等使用薄膜水化法制备的以脂质体为外壳，包裹全氟丙烷的造影剂，粒径在440纳米左右，通过体外实验发现超声增强效果略低于微泡。在体内实验中，通过BALB/c裸鼠的前列腺肿瘤模型，发现纳米泡在肿瘤部位造影增强效果达到了15分钟，而微泡只有2分多钟。进一步使用激光共聚焦显微镜进行分析显示，纳米泡确实进入了肿瘤组织内部，进而验证了纳米造影剂能够穿透肿瘤血管内皮间隙进入其组织内部的能力，从而证实了利用纳米造影剂可有效地提高对肿瘤早期诊断能力。另外，还有一些学者将微泡与纳米泡结合到一起，充分发挥各自的优点。2015年Huynh[30]等制备了粒径在1-10微米，以全氟化碳为核的微米级造影剂。当进入体内后，这些微泡在低频超声的作用下破裂成5-500纳米的多个纳米泡对肿瘤进行靶向分子成像。该方法既利用了微泡较强的散射信号能力，又发挥了纳米泡很好的穿透性，为UCA的研究提供了一种新的思路与途径。

3.2 纳米级UCA研究进展

对于纳米级造影剂的应用研究始于20世纪90年代。1996年，Lanza[31]等制备了以生物素化的脂质体为外壳材料，包裹有全氟化碳乳液的纳米级造影剂，在狗的体内试验中证实可对动脉血栓进行显像，但由于核心为液体，致使其背向散射能力远低于含气泡的造影剂。2004年，Oeffinger[32]等通过超声声振法制备出平均粒径在450-700纳米，包裹有全氟丙烷气体的纳米泡造影剂。在体外实验中，通过塑胶管观察到了较好的造影增强效果，最大可增强27dB，且达到一定浓度时增强效果出现饱和状态。2006年，Wheatley等人又将该纳米泡应用到大兔体内[33]，在能量多普勒和脉冲反相谐波成像中获得了20-25dB的图像增强。2013年Exner[34]等使用非离子表面活性剂Pluronic控制尺寸制备出了平均粒径在200纳米的造影剂。通过与微泡Definity比较，发现该纳米泡在三种不同谐波频率（3.5，6.2和8 MHz）下回波信号比Definity更强。小鼠皮下肿瘤模型显示纳米泡和Definity的峰值增强没有显著差异，且在前200秒，肿瘤和肾脏中纳米泡的衰减速率明显低于Definity。2017年Exner[35]等又制备了一种新的由表面活性剂和脂质体为包膜，填充气体为全氟丙烷的纳米泡，其粒径更小，只有95纳米左右。在体外实验中，信号增强时间达到了24小时。在老鼠的皮下肿瘤模型实验中，比微泡能更好地渗透和滞留在肿瘤中。

国内对纳米级UCA的研究虽然起步较晚，但也取得了很多成果。2003年，西安交通大学的万明习[36]等采用声空化的方法，以酯类表面活性剂为主要外壳材料﹑六氟化硫为内核制备出粒径为3.95微米﹑浓度为3.625×109 ml--1的纳米级微泡。体外实验中观测到了声学屏蔽显像，体内实验中对犬的左右心室﹑心肌﹑肝脏﹑肾脏的造影灌注效果十分显著。2008年重庆医科大学的王志刚[37]等使用高压均质法研制出了液态氟碳脂质纳米泡造影剂，粒径在171.9±91.0纳米，体外实验中显示为高回声。2010年北京大学的戴志飞[38]等通过超声声振法，将Span 60和聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的混合液中较大部分分离出去，制成了平均粒径为1.1-2.0微米的微泡造影剂。体内实验中，在兔的肾脏部分出现了显著的造影增强表现。2012年中山大学的王平[39]等研制出粒径为436.8±5.7纳米﹑分布均一的脂质造影剂，在体外实验中显示出良好的增强效果，体内实验中在小鼠皮下肿瘤处具有增强的渗透性和较长的滞留性。2013年华中科技大学的周琦冰[40]等采用超声空化法制备了平均粒径为359.3纳米，并连接有Cyanine 5.5荧光染料的双模UCA，体内小鼠实验证明该纳米泡能进入肿瘤内部，滞留时间超过24小时。2015年，第四军医大学的段云友[41]等用机械振荡法制备出纯粒径的纳米泡，然后又通过生物素-亲和素法将乳腺癌细胞HER2偶联到纳米泡表面。在荷瘤裸鼠试验中，实现了对乳腺癌肿瘤的特异性靶向增强显影。2016年，上海交通大学的李凤华[42]等将HER2抗体和VEGFR2抗体连接到聚乳酸羟基乙酸为包膜的纳米粒子上，制成了双靶向纳米高分子UCA。物理检测其粒径为152.00±58.08纳米﹑呈球形﹑分布均匀。体外寻靶实验证实，该造影剂对血管内皮细胞SVR和乳腺癌细胞SKBR3都有很好的聚集性。

3.3 纳米级UCA在肿瘤诊断与治疗中的应用

恶性肿瘤是严重威胁人类安全的疾病之一，根据世界卫生组织2014年的统计结果，全年新发恶性肿瘤病例约1409万，死亡约820万[43]。目前临床上对于恶性肿瘤的治疗手段有手术切除﹑放疗﹑化疗等。由于恶性肿瘤初期藏匿性高，大多数患者在发现时已属中晚期，癌细胞扩散到身体多个部位，手术完全切除难以施行，化疗和放疗成为主要的治疗手段[44]。然而，化疗药物大多为细胞毒性药物，进入人体后，缺乏对肿瘤细胞和正常细胞的特异性和靶向性，会产生较大的毒副作用。而放疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法，在许多癌症的治疗中可以产生较好效果，但是放疗会产生放射性皮炎﹑放射性食管炎以及食欲下降﹑恶心﹑呕吐﹑腹痛﹑腹泻﹑便秘等诸多毒副反应。因此，研究能够减少患者不良反应﹑提高肿瘤治疗效果就成为当前抗肿瘤领域的重点。利用靶向药物治疗肿瘤相比于传统的静脉给药，具有药剂用量少﹑毒副作用小﹑药效利用度高﹑长时间保持靶目标等优势。在靶向治疗过程中，为了将药物定点输送到肿瘤部位，需要借助于一定的载体。目前常用的载体技术包括病毒载体和非病毒载体[25]，前者存在的主要问题是致突变性和免疫原性，后者主要问题是转染率低﹑靶向性差。而利用造影剂微泡介导的靶向传输治疗不仅可以增强裸质粒DNA的基因转染和表达，还可以增加肿瘤治疗的靶向性，是一种很有前途的肿瘤载体治疗技术。新发展的纳米造影剂由于粒径更小，可以穿透血管内皮细胞间隙直接进入肿瘤组织内部，可作为一种多功能的诊断治疗于一体的纳米药物载体。为了让纳米造影剂更好地靶向到肿瘤位置，通常在其外壳连上特异性的配体，形成靶向纳米造影剂。这些靶向配体主要为靶向抗体和靶向多肽，如整合素iRGD﹑anti-VEGF抗体﹑PD-L1抗体﹑细胞穿透肽pHLIP等。经过靶向修饰的负荷有治疗药物的纳米造影剂进入体内后，可以特异性的和肿瘤中的表达受体相结合，在EPR效应下大量聚集于靶向部位并释放出药物，提高诊断和治疗的能力。

因此，靶向纳米造影剂不仅在分子成像上可增强病灶部位显影，提高诊断的准确率，还可以在靶向治疗中通过定点给药，实现肿瘤的生长抑制。目前对于纳米造影剂的研究仍处于实验阶段，距离临床使用尚有许多亟待解决的问题[45]，主要有:（1）纳米造影剂的制作还不成熟，没有一个统一的粒径标准。检测手段及成像方法还是沿用微泡造影剂，没有根据纳米级的特征，提出专门的方法；（2）纳米造影剂由于粒径太小，包膜内含气决定了其载药率较低；（3）纳米造影剂虽然可以通过修饰包膜，连上靶向物增加其靶向性，但体内的微环境机制复杂，纳米泡可能重新聚集成了微泡或者只有较少的一部分到能达靶向位置。总之纳米造影剂作为一种新兴的技术，虽然还有很多地方不够完善，但随着生物科学﹑纳米技术及超声医学的进一步发展融合，纳米造影剂凭借自己独特的优势，在分子影像学和治疗学上一定会有更广阔的前景[46]。

4 结束语

UCA的出现扩展了超声诊断的范围，提高了诊断的敏感性和特异性，使超声成像进入了分子成像的时代，被誉为超声领域的又一次革命。同时，在许多疾病的诊断上，它也是与MRI﹑CT等各具特色的成像技术。UCA的发展和应用依赖于UCA制备工艺的提高以及超声成像设备与技术的发展。UCA的制造已经从微米级转向纳米级，靶向性的需求使得UCA的制造技术更加复杂。另外，当前商用超声机的成像算法和探头都是专为微米级造影剂设计的，为了最大程度的研究纳米造影剂，我们必须根据其本身的特征，研究对应的成像设备和算法，只有不断的发展完善，才能更好的造福人类。

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Research Status and Advances of Contrast Agents-based Medical Ultrasound Imaging

Yu Houqiang1, He Xiaoling2, Ding Mingyue1*
(1.College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China; 2.University hospital, China University of Geosciences, Wuhan 430074, China)

Contrast agents-based ultrasound imaging is a new medical ultrasound mode that can significantly enhance the detection of medical ultrasound signal.In this paper, the past, development, characteristics and application of ultrasound contrast agents were given in a brief overview.Especially, we provided the highlight information of analysis of signal, imaging algorithms, research progress and clinic applications of nanoscale contrast agent.The prof i les are useful as a def i nitive reference to comprehensive understanding of contrast-agents-based ultrasound imaging.

Ultrasound contrast agent; Imaging algorithm; Nanoscale; Target

R445.1 [Document Code] A

10.11967/ 2017150201

R445.1

A DOI：10.11967/ 2017150201

国家973项目(2011CB933103)﹑高等学校博士学科点基金(20130142130006)﹑国家自然科学基金(81571754)资助

姓名：余后强，性别：男，学历：博士在读，职称：讲师，出生年月：1979年7月20日，单位：华中科技大学生命科学与技术学院，联系地址：湖北省武汉市珞喻路1037号华中科技大学启明学院502室，邮政编码：430074，E-mail：yhq9750@qq.com，固定电话：027-87792366，手机：15272684177

⋆通讯作者介绍：丁明跃， 性别：男，学历：博士，职称：教授，单位：华中科技大学生命科学与技术学院，联系地址：湖北武汉市珞喻路1037号华中科技大学生命科学与技术学院505室，邮政编码：430074，E-mail：myding@hust.edu.cn，固定电话：027-87792366，手机：13808664983，专业方向：生物医学工程。