葛根素对糖尿病肾病大鼠足细胞podocalyxin的影响※

张嬿詹华奎涂翔罗梅吕春燕

葛根素对糖尿病肾病大鼠足细胞podocalyxin的影响※

张嬿1詹华奎1涂翔2罗梅1吕春燕3

（1成都中医药大学附属医院/临床医学院西内教研室，成都610075；2成都中医药大学附属医院/临床医学院糖尿病基地办，成都610075；3成都中医药大学附属医院/临床医学院病理科，成都610075）

目的探讨葛根素对糖尿病肾病（DN）大鼠足细胞podocalyxin的影响。方法将雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（N组）、糖尿病肾病组（DN组）、DN葛根素治疗组（P组）、DN厄贝沙坦治疗组（I组），干预8周后应用实时定量RTPCR法检测各组大鼠肾皮质podocalyxin mRNA表达。结果podocalyxin mRNA表达N组较I组、P组高（P<0.05），DN组最低（P<0.05），I组较P组略高，但无统计学差异（P>0.05）。结论葛根素可拮抗DN大鼠足细胞podocalyxin降低，对足细胞有一定的保护作用。

葛根素；糖尿病肾病；足细胞；podocalyxin；消渴；水肿；动物实验

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，目前已成为导致终末期肾病的主要病因，其发病机制尚不完全清楚。其中肾小球脏层上皮细胞（即足细胞）形态结构及相关分子的改变在DN发生发展过程中所起的作用引起了广泛关注。Podocalyxin是足细胞特异标识蛋白之一，现已证明podocalyxin在肾小球发育过程中与足突的分化密切相关，如果将小鼠的podocalyxin基因敲除则不能形成足突和裂隙隔膜，并且在出生24 h内无尿而死亡。Podocalyxin作为足细胞分化成熟的标识蛋白日益受到人们的重视。

上世纪葛根素开始应用于糖尿病及其并发症的研究，尤其在糖尿病肾病方面取得了一定的疗效。本研究以西药血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦为对照，观察葛根素对足细胞podocalyxin mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 DN大鼠模型制备与分组4周龄雄性Wistar大鼠适应性喂养1周，剔除空腹血糖>7 mmol/L或尿蛋白试纸法阳性大鼠，随机分为正常对照组（N组）和造模组。造模组大鼠禁食12 h后一次性腹腔内注射链脲佐菌素STZ 55 mg/kg；N组腹腔注射等量枸橼酸钠溶液。注射STZ后每3日测1次血糖，连续2周血糖均>16.7 mmol/L，2周后24小时尿量>造模前150%，24小时尿蛋白定量>造模前150%确定DN大鼠造模成功[1]。将造模成功大鼠随机分为DN组、葛根素治疗组（P组）、厄贝沙坦治疗组（I组）。全部大鼠在同一动物房内分笼饲养，标准饮食。N组和DN组给予生理盐水2 ml/d灌胃，P组给予葛根素注射液50 mg/kg/d腹腔注射，I组给予50 mg/kg/d溶于2 ml水制成混悬液灌胃，共观察8周。8周后N组、DN组、P组、I组分别存活10只、6只、8只、8只大鼠。

1.2 生化指标测量采用德国拜耳-拜安捷血糖仪尾部针刺取血测量血糖，造模前、成模后大鼠每周测定1次血糖，实验结束前测定各组大鼠血糖；造模前、造模后第2周末及实验结束前使用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，测尿量、检测24 h尿蛋白定量；最后断颈处死大鼠，心脏取血检测血清肌酐、尿素氮。

1.3 实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）取左肾上极部分肾皮质，放入液氮冻存，使用TaqMan荧光探针法检测podocalyxin mRNA，用其Ct值减去内参Ct值，得到△Ct值，每一组的△Ct求平均值及标准差，以2－△Ct表示该组podocalyxin mRNA的表达。（附：内参β-actin上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，扩增长度150bp；podocalyxin上游引物5’-CATTGACCAGAACCAAGACAAA-3’，下游引物5’-AGTAGGTTGAGAAGAGGCGTTG-3’，扩增长度310 bp）。1.4统计学方法采用SPSS 16.0统计分析，结果用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，经方差齐性检验（Homageneity of variance test），如果方差齐者采用LSD，方差不齐采用Tamhane’s T2统计方法。两组间关系比较采用直线相关分析。以双侧P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标造模前各组大鼠体重、血糖、24 h尿量、24 h尿蛋白定量无差异（P>0.05）；实验结束时各组生化指标比较（见表1），各组间血肌酐、尿素氮无差异（P>0.05）；血糖从高到低依次为DN组、P组、I组、N组，N组与其它三组比较有差异（P<0.05），其它三组间无差异（P>0.05）；24h尿蛋白定量从高到低依次为DN组、I组、P组、N组，N组与其它三组比较有差异（P<0.05），DN组与I组和P组比较有差异（P<0.05），I组和P组间无差异（P>0.05）。

2.2 实时定量RT-PCR podocalyxin mRNA表达（见表1）N组较I组、P组高（P<0.05），DN组最低（P<0.05），I组较P组略高，但无统计学差异（P>0.05）。将24 h尿蛋白定量与其进行相关性分析，二者呈负相关（r＝-0.780，P<0.05）。

表1 实验结束时各组大鼠生化指标及podocalyxin mRNA表达(2－△Ct）比较（x±s）

3 讨论

祖国医学认为糖尿病属“消渴”，阴虚燥热是其主要病机之一，病人日久阴亏津伤，血液黏滞而致瘀。中药葛根，性甘凉，有生津止渴之功，常与芦根、天花粉、知母同用治内热消渴。从《神农本草经》开始，即记载了“葛根，味甘平，主消渴、热、呕吐、清痹、起阴气、解消毒。”并明确生津、升发脾胃清气可用于治疗消渴，历代用来治疗糖尿病的方剂也不乏其例，如张锡纯的《医学衷中参西录》中的玉液汤即用到葛根来治疗消渴。现代循证医学Meta分析[2]亦发现葛根素可减少DN患者尿微量白蛋白、降低空腹血糖。

足细胞通过其足突同毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜构成了肾小球的滤过屏障，是蛋白质滤过的最后一道屏障，其损伤、脱落与蛋白尿的发生、新月体的形成等密不可分，特别是与肾小球的硬化密切相关[3]，目前国内外学者[4-5]将足细胞的损伤作为肾脏损伤的早期检测指标之一，包括DN[6-7]。Podocalyxin属于CD34家族成员之一，其分子量为140～160 kD，是富含负电荷的唾液黏蛋白，由肾小球内皮细胞和足细胞合成，在足细胞成熟过程中固定于肾小球足细胞顶膜，已成为足细胞最稳定的标志物之一。

本实验结束时四组大鼠肾功能比较无差异；DN组、P组与I组血糖、24 h尿蛋白定量均较N组升高，三组间比较血糖虽无差异，但24 h尿蛋白定量P组、I组较DN组有所下降，而podocalyxin mRNA表达P组、I组较DN组有所增加，提示葛根素能降低早期DN大鼠24 h尿蛋白定量，增加podocalyxin mRNA表达，且其作用与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦相似；此外24 h尿蛋白定量与podocalyxin mRNA表达间存在负性相关，提示DN大鼠尿蛋白的出现与podocalyxin mRNA表达的降低有一定关系，而增加podocalyxin mRNA表达或许是药物（葛根素、厄贝沙坦等）治疗DN蛋白尿的机制之一。

4 结论

DN大鼠在肾功能尚未发生改变时，已经出现了蛋白尿及足细胞podocalyxin mRNA表达的降低，而中药葛根素对此有一定的抑制作用，但其具体机制仍需进一步探讨。

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The Effects of Puerarin on Podocyte Podocalyxin in Diabetic Nephropathy Rats

ZHANG Yan1,ZHAN Huakui1,TU Xiang2,LUO Mei1,LYU Chunyan3
(1.Department of Western Internal Medicine of Clinical Medical College,the Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China; 2.Diabetes Mellitus Base Office of Clinical Medical College,the Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075,China; 3.Pathology Department of Clinical Medical College,the Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075,China)

Objective To assess the effects of Puerarin on podocyte podocalyxin in diabetic nephropathy(DN)rats.Methods Male Wistar rats were randomly divided into normal group(N),diabetic nephropathy group(DN),treated by puerarin group(P)and treated by Irbesartan group(I).After 8 weeks,the mRNA expressions of podocalyxin were observed by RT-PCR.Results Comparing with N group,the podocalyxin decreased in P,I and DN group,especially DN group(P<0.05).There had no differences between P group and I group(P>0.05).Conclusion Puerarin can protect podocytes in DN rats by suppressing the reduction of podocalyxin.

Puerarin;diabetic nephropathy;podocyte;podocalyxin;consumptive thirst;edema;animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.11.063

1672-2779（2017）-11-0143-02

：杨杰本文校对：何王华

2017-03-20）

成都中医药大学科技发展基金【No.ZRYB201012】