脓毒症患儿CD14+单核细胞中miR-146a的表达及其临床意义

武宇辉, 齐 颖, 马伟科, 李雨铮, 杨卫国, 李成荣

(广东省深圳市儿童医院 PICU, 广东 深圳, 518038)



脓毒症患儿CD14+单核细胞中miR-146a的表达及其临床意义

武宇辉, 齐 颖, 马伟科, 李雨铮, 杨卫国, 李成荣

(广东省深圳市儿童医院 PICU, 广东 深圳, 518038)

目的 观察儿童脓毒症患者CD14+单核细胞(MC)中miR-146a的表达水平。方法 选取 40例脓毒症患儿。选择15例手术后全身性炎症反应综合征(SIRS)患儿和15例健康儿童作为对照组。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测CD14+MC中miR-146a水平和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)的表达水平。流式细胞仪检测CD14+MC HLA-DR水平。测定外周血超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)水平。结果 脓毒症患儿CD14+MC的HLA-DR水平均>30%。脓毒症患儿CD14+MC的miR-146a表达水平较SIRS组和健康对照组显著升高(P<0.05), 在恢复期其水平显著下调(P<0.05)。脓毒症患儿CD14+MC的TNF-α、IL-10水平均较健康对照组显著升高(P<0.05)。结论 脓毒症患儿CD14+MC中miR-146a表达上调。

儿童; 微小RNA-146a; 脓毒症; CD14+单核细胞

脓毒症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征(SIRS)。如果早期持续的SIRS未能得到有效控制，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，是PICU危重患儿的主要死亡原因之一[1]。微小RNA(miRNA)是一种非编码RNA, 在转录后水平调节基因表达。既往研究[2]表明，某些miRNA在炎症反应中发挥重要作用，参与脓毒症的发生发展。为进一步探讨miRNA在脓毒症患儿中的临床意义，作者检测了脓毒症患儿外周血CD14+MC中miR-146a及其相关炎症因子的表达水平，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年9月—2016年3月在本院PICU住院的40例脓毒症患儿，男23例，女17例，平均年龄2.13±0.94岁，7例死亡。所有患儿均符合2012版脓毒症国际指南诊断标准[1]。脓毒症患儿中腹腔感染16例，肺部感染13例，颅内感染3例，皮肤软组织感染5例，泌尿系感染3例。31例血培养阳性，7例死亡。选取同期住院的15例外科手术后患儿作为SIRS组(所有患儿在术后24 h均发生SIRS且在接下来的1周内没有发生脓毒症)，15例来医院体检的同龄健康儿童作为对照组。各组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过了医院伦理委员会的审批，所有检查均得到患儿家属的知情同意。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫磁珠分离外周血CD14+MC: 脓毒症组患儿在入住PICU后诊断脓毒症6 h内，无菌采集静脉血2 mL用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na2)抗凝，通过Dynabeads®CD14(美国, Invitrogen)提取CD14+MC, 加入QIAZOL溶液0.7 mL, 吹打混匀，置于-80 ℃冰箱保存备用进行PCR检测。留取血标本常规送检血常规、hs-CRP梁蚉CT。存活的脓毒症患儿在治疗2周后病情恢复期复查以上各项目。

1.2.2 流式细胞术检测外周血CD14+MC的HLA-DR表达: 留取外周静脉血3 mL, 血标本收集后均立即送检。采用全血计数法，用FITC-CDl4, APC-HLA-DR(抗体及同型对照所需试剂均购自美国Bioscience公司)行细胞表面染色，避光孵育30 min, 以FITC-CDl4设门，流式细胞仪(美国BD公司，FACS CantoⅡ)计数检测CD14+MC的HLA-DR表达，全部数据经FACS Diva Ver 6.1.3软件获取分析。

1.2.3 荧光实时定量(RT)-PCR: CD14+MC总RNA及miRNA提取及定量: 按miRneasy Mini试剂盒(德国QIAGEN公司)说明书步骤，从添加QIAZOL溶液的外周血CD14+MC分离总RNA并进行纯化。紫外分光光度计测定260 nm(A260)的吸收值计算RNA 浓度，保证在0.15～1.0。 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-146a: 白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α): ① 逆转录(RT-PCR)及产物鉴定: 羗iR-146a按miScript Ⅱ RT Kit说明，经逆转录合成cDNA, 测定引物由QIAGEN公司设计合成，以Hs-RNU6-2(MS00033740)为内参。普通mRNA按试剂盒(美国Thermo公司)说明，反转录合成cDNA, 再进行PCR扩增35～50个循环，取扩增产物10 μL, 2%琼脂糖凝胶中，90V电泳30 min，回收纯化，并送交上海Invitrogen公司测序，测序结果与GeneBank中目的基因mRNA序列完全一致。根据Gene Bank中基因mRNA序列设计目的引物(由上海Invitrogen公司合成)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。② 荧光定量PCR(qRT-PCR): 罷NF-α、IL-10测定采用SYBR Green Kit(德国QIAGEN公司), miR-146a测定采用SYBR Green Kit(德国QIAGEN公司)，每个反应体系均为15 μL, 使用罗氏LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪检测其表达，每个反应设3个复孔，采用内参进行归一化。具体操作参照说明书。待测因子表达应用Relative Quantification Software Ver1.0软件进行数据分析，结果以目的基因/GAPDH或U6比值表示。

1.3 统计学处理

所有数据分析均用SPSS 17.0统计软件包进行，经正态性检验和方差齐性(F检验)检验后，符合正态分布，方差齐性的数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单相方差分析(ANOVA), 进一步进行LSD-t检验; 非正态分布的资料以中位数(25百分位数, 75百分位数)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脓毒症患儿miR-146a及其炎症因子检测结果

所有脓毒症组患者HLA-DR均>30%。脓毒症患者miR-146a表达水平较SIRS和健康对照组水平均升高，且在恢复期水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组患儿TNF-α表达水平虽较健康对照组显著升高(P<0.05), 但在脓毒症和SIRS之间无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2 超敏CRP和PCT检测结果

脓毒症患儿hs-CRP和PCT分别为57.70(39.83, 82.30) mg/L和6.05(1.19, 24.78) ng/mL, 较SIRS组39.30(29.00, 48.20) mg/L和1.10

表1 miR-146a及相关炎症因子的表达水平

与脓毒症组比较, *P<0.05; 与SIRS组比较, #P<0.05; 与健康对照组比较, △P<0.05。

(0.51, 1.94) ng/mL及健康对照组0.08(0.06, 0.20) mg/L和0.09(0.06, 0.12) ng/mL均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

脓毒症是儿童重症监护病房常见的危重症，也是导致患者死亡的主要原因之一[3]。脓毒症发生发展过程中促炎/抗炎反应同时存在，机体处于一种复杂的免疫紊乱和动态失衡中[4-5]。本研究中脓毒症患者单核/巨噬细胞中IL-10、TNF-α均升高，支持了这一观点。

miRNA是一类长约21～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，目前发现与人类密切相关的miRNA近千种，与生理状态的改变以及疾病的发生、发展密切相关。miRNA参与调节炎性细胞和介质的表达，其中miR-146a不但在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病及特异性湿疹等多种与自身免疫系统相关的疾病的发生、发展过程中发挥重要作用，也参与脓毒症的发生发展[6-7]。IRAK-1和TRAF-6已被证实是miR-146a的直接靶分子[8-9]。miR-146a作为一个负调控分子，主要依靠互补结合于肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)和白介素1受体相关激酶-1(IRAK-1)的3′7UTR区域，在转录后水平抑制TRAF-6和IRAK-1的水平，负向调节核转录因子-κB(NF-κB)的活性，对免疫信号转导起负反馈调节作用，减轻炎症因子的释放。

单核巨噬细胞是脓毒症发病机制中宿主防御各种微生物入侵的核心因素[10-11]。单核细胞CD14是一种细菌细胞壁碎片识别受体，是成熟单核细胞的标志，在对细菌病原体的免疫反应中起到重要作用。既往多个研究[12-14]显示，CD14+单核细胞HLA-DR水平是判断脓毒症患者免疫状态的检测指标。HLA-DR<30%提示患者存在免疫抑制状态。为了更好的反映miR-146a的水平，本组患者入选时排除了免疫抑制的患者，所有患儿入院时HLA-DR均>30%，提示本组入选的脓毒症患者急性期处于促炎反应占优势的状态。对照组患儿HLA-DR水平与既往研究相仿[15]，同时研究结果显示此时患者血液中存在高表达水平的促炎症因子和抗炎因子，外周血CD14+单核细胞中miR-l46a同样处于高表达状态。患者的超敏CRP和PCT也明显升高，随着治疗的进行，脓毒症恢复期患者miR-l46a的表达水平较治疗前下调，提示机体促炎和抗炎过程重新达到平衡，使免疫内稳状态得到一定的恢复。目前也有学者[16]发现，在进行血液滤过后患者miR-146a的表达水平降低，患者的达到免疫平衡的病程缩短，恢复更快。本组脓毒症患者miR-146a的表达水平较SIRS患者和健康对照组水平升高，与既往研究结果一致[17]。提示测定脓毒症患者外周血miR-146a的表达也可以作为判断患者的感染炎症指标之一，有助于脓毒症的早期诊断和治疗。

总之，脓毒症患者外周血CD14+MC中miR-146a表达升高，有助于脓毒症的早期诊断和病情评估，也为脓毒症的基因靶向治疗提供了新的研究方向。

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Expression and clinical significance of miRNA-146a in CD14+MC of children with sepsis

WU Yuhui, QI Ying, MA Weike, LI Yuzheng, YANG Weiguo, LI Chengrong

(PICU,ShenzhenChildren′sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518038)

Objective To investigate the expression of miR-146a in CD14+monocytes (MC) of children with sepsis. Methods Forty children with sepsis in PICU were enrolled in the study. Fifteen children with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) after surgical treatment and fifteen healthy children were selected as control group. Expressions of miR-146a and TNF-α, IL-10 of CD14+MC were detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). HLA-DR levels of CD14+MC were detected by flow cytometry. Levels of high-sensitivity C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT) were detected. Results The HLA-DR levels of CD14+MC in all the children with sepsis were over 30%. The miR-146a level of CD14+MC were significantly higher in sepsis group than SIRS group and healthy controls (P<0.05), and the level decreased when sepsis children were recovered (P<0.05). The TNF-α, IL-10 level of CD14+MC in children with sepsis was significantly higher than healthy controls (P<0.05). Conclusion The expressions of CD14+MC miR-146a in children with sepsis are significantly up-regulated.

children; miR-146a; sepsis; CD14+monocytes

2016-12-24

广东省深圳市科技计划项目(JCYJ20140416141331523)

李成荣, E-mail: 418027143@qq.com。

R 631

A

1672-2353(2017)09-119-04

10.7619/jcmp.201709031