黑曲霉果糖基水解酶的重组表达及酶学特征分析

董自星,肖 华,王静培,张志萌,王 君,路福平,*

(1.天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457)



黑曲霉果糖基水解酶的重组表达及酶学特征分析

董自星1,2,肖 华2,王静培2,张志萌2,王 君2,路福平2,*

(1.天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大学生物工程学院与工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457)

目的:果糖基转移酶在新型果糖基衍生品的制备过程中具有重要作用,获得酶活高、性能优良的果糖基水解酶是关键。方法:利用MEGA 4.0以及Clustal X2等软件对黑曲霉的基因组进行分析,遴选了5个果糖基水解酶基因,接着将它们在毕赤酵母中进行了克隆表达,并研究了重组酶的酶学性质。结果:在摇瓶水平上,重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/mL,远高于目前已报道的果糖基水解酶的酶活。重组酶Fru1的最适反应温度和pH分别为45 ℃和5.5,EDTA对它有微弱的促进作用,Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+和Ca2+会轻微地抑制酶活,该酶对蔗糖既有水解作用,又有转苷活性,还可以水解菊粉中的二糖到五糖;重组酶Fru5的最适反应温度和pH分别为50 ℃和5.0,Li+、Na+和EDTA对其酶活有促进作用,但Fe2+则强烈抑制酶的活性,它还可以水解蔗糖以及菊粉中几乎所有的大分子糖。结论:本研究为果糖基水解酶的工业化生产及其在新型果糖基衍生品制备过程中的应用提供了可能途径。

果糖基水解酶,新型果糖基衍生品,黑曲霉,重组表达,酶学性质

在自然界中,果糖以单体形式大量存在于水果和蜂蜜中;果糖和葡萄糖通过糖苷键连接形成蔗糖,其广泛分布于甘蔗和甜菜中;以果聚糖形式(菊粉)存在于细菌、真菌和高等植物中[1]。果糖及其果糖基衍生物(如高果糖浆、果葡糖浆、结晶果糖和低聚果糖等)因其具有独特的甜度与生理保健功能,在医药、食品、乳制品、保健品以及饲料行业具有良好的应用前景。

果糖基水解酶在新型果糖基衍生品的制备过程中起着重要作用。它们包括细菌、真菌和植物来源的蔗糖酶(invertase)、菊粉酶(inulinase)、果聚糖酶(levanase)以及果聚糖蔗糖酶(levansucrase)等[2]。其中蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可以将蔗糖水解为果糖和葡萄糖,用于果葡糖浆的生产。与传统酸水解法相比,酶法具有精制工序简单、产品品质好等优点,有利于果葡糖浆的工业化生产[3]。此外,蔗糖酶还具有果糖基转移活性,可以产生低聚果糖(fructooligosaccharides)[4]和低聚乳果糖(lactosucrose)[5]等。利用菊粉外切酶(EC 3.2.1.80)生产高果糖浆(high fructose corn syrup)是目前最好的方法。该法对设备要求低,可直接将菊粉转化成95%(w/v)以上的果糖,易于分离纯化[6]。可以替代以淀粉为原料,经α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶酶解生产高果糖浆的方法[7]。菊粉内切酶则可以用来生产低聚果糖等[8]。

表1 引物列表Table 1 Primers used in this study

注:下划线部分为限制性酶切位点。长期以来,作用于果糖或果糖基的酶系一直没有得到深入研究。虽然国内外专家也对菊粉酶等进行了许多研究,但是基本上都停留在实验室水平,工业应用规模很少[9]。其主要原因是微生物产酶量低,酶制剂生产成本高。因此,筛选高表达的新菌种或构建高表达的重组菌是解决这个问题的主要方法。

本文采用生物信息学的方法从黑曲霉基因组中遴选到5个可能的果糖基水解酶基因。并以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到cDNA。以此为模板,并将其果糖基水解酶基因在毕赤酵母中进行克隆与表达,进而研究重组酶的酶学性质,为后续果糖基水解酶的工业化生产、基因水平的改造及其在新型果糖基衍生品制备过程中的应用提供可能途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(EscherichiacoliJM109) 由本实验室保藏;黑曲霉(AspergillusnigerCICIM F0510) 从自然样本分离保藏的野生菌株,由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供;毕赤酵母(PichiapastorisGS115)和质粒pPIC9K 购于Invitrogen公司;大肠杆菌的培养采用LB培养基;黑曲霉采用PDA培养基进行培养;毕赤酵母及其重组菌的培养基及其培养方法按照Invitrogen公司的毕赤酵母操作手册进行;本研究中用到的引物根据美国国立生物技术信息中心的网站(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)上公布的序列进行设计,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具体见表1;限制性内切酶、LA Taq DNA聚合酶、连接酶和RNA反转录试剂 均购于TaKaRa公司;TRNzol总RNA提取试剂 由康为世纪生物科技有限公司提供;Plasmid Mini Kit I和小量DNA产物纯化回收试剂盒 购自OMEGA Bio-Tek公司;胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract) 英国OXOID公司产品;其它试剂 均为国产分析纯。

PTC-200型PCR仪 MJ Research Inc.;DYY-III-6B型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂;全自动凝胶成像仪 美国SYNGENE公司;Gene Pulser Xcell电转仪 美国BIO-RAD公司;HW SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;SP-2012UV型分光光度计 上海光谱仪器有限公司;Agilent HP 1100高效液相色谱仪 美国惠普公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果糖基水解酶的生物信息学分析 利用NCBI查询不同来源的果糖基水解酶的氨基酸序列。通过软件MEGA 4.0以邻近法(Neighbour-joining)构建进化树[10],分析它们亲缘关系的远近,并通过软件Clustal X2和BioEdit对这些酶的氨基酸序列进行比对和分析。

1.2.2 黑曲霉果糖基水解酶基因的克隆 采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉的总RNA。以总RNA为模板,以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA,然后分别以第1链cDNA为模板进行PCR,扩增出5个果糖基水解酶基因(引物见表1)。基因的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。分别将PCR产物与质粒pPIC9K用SnaB I和EcoR I进行酶切,再将它们纯化后进行连接,转化E.coliJM109感受态细胞。筛选阳性转化子,并提取其质粒进行酶切验证。

1.2.3 阳性重组菌的筛选和表达 将构建成功的5个重组质粒以及对照空质粒pPIC9K均用Sal I进行线性化。酶切产物经纯化回收后电转化[11]P.pastorisGS115,均匀涂布于MD平板,30 ℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2 mg/mL的YPD/G418平板上进行筛选,于30 ℃培养箱培养至长出单菌落,挑取生长情况好的重组酵母菌株保存。

将构建成功的毕赤酵母重组菌GS115(pPIC9K-fru1)、GS115(pPIC9K-fru2)、GS115(pPIC9K-fru3)、GS115(pPIC9K-fru4)和GS115(pPIC9K-fru5)在YPD平板上进行纯化,挑取单菌落接种于YPD液体培养基中,30 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期(OD600=2～6,约18～20 h)。按1%(v/v)接种量接入25 mL BMGY培养基中,30 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期。室温下5000 r/min离心5 min收集酵母细胞,弃上清,将细胞重悬于50 mL BMMY培养基中至OD600=1.0,30 ℃继续培养并开始诱导。每隔24 h补加0.5%的甲醇以维持诱导,同时取样进行酶活测定。发酵结束后,12000 r/min离心10 min收集发酵上清液,即为粗酶液,-20 ℃保存备用。

1.2.4 果糖基水解酶的酶活测定 以蔗糖为底物,采用DNS法[12]进行酶活测定。取9 mL含有10%(w/v)蔗糖的0.1 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)于三角瓶中,加入1 mL酶液,充分混匀后,于50 ℃、200 r/min水浴摇床反应60 min。然后取上清液进行适当稀释,使糖的浓度为0.1～0.8 mg/mL。取稀释后的糖液0.5 mL于15 mL刻度试管中,加DNS试剂1.5 mL,沸水煮沸15 min,冷却后加入10.5 mL去离子水,在540 nm波长下测定吸光度。用葡萄糖绘制标准曲线,获得的标准曲线方程为y=0.648x-0.0143,R2=0.9975。

酶活单位定义:在最适条件下,每分钟水解蔗糖产生1 μmol的葡萄糖所需的酶量即为1个酶活力单位。

1.2.5 最适反应温度和热稳定性的测定 在不同温度(30、40、45、50、55、60、65 ℃)和pH6.0的缓冲液条件下,测定酶活,将酶活最高者定为100%,其它温度下的酶活与最高酶活的比值即为待测酶液在该温度下的相对酶活;将酶分别置于上述温度的恒温水浴中保温60 min,迅速取出测定残余酶活力。以未经水浴处理的酶活为100%,以残余酶活力对温度作图。

1.2.6 最适作用pH和pH稳定性的测定 用不同pH的0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和50 ℃条件下测定酶活,酶活数值最大者计为100%;在上述不同pH的缓冲液里和50 ℃的条件下保温60 min,迅速取出进行酶活反应,测定重组酶的活力。酶活数值最大者计为100%。

1.2.7 金属离子和螯合剂对酶活的影响 在果糖基水解酶与其底物进行反应的体系中,加入终浓度为5 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ni2+、Mn2+、Li+和EDTA,在最适反应pH和温度下测定(Fru1,pH5.5、45 ℃;Fru5,pH5.0、50 ℃)果糖基水解酶的酶活。以不加金属离子和螯合剂的反应体系的酶活为100%。

1.2.8 底物催化特征分析 按照酶活测定的方法,分别以10%(w/v)的蔗糖和菊粉为底物,将酶与底物在50 ℃反应60 min后,沸水浴10 min,冷却至室温后8500 r/min离心4 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤后,进行高效液相色谱分析。色谱条件:高效液相色谱仪(蒸发光散射检测器)进行检测,色谱柱为PrevailTMCarbohydrate ES 5 μ糖柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);检测器为蒸发光散射检测器,其漂移管的温度为90 ℃,气体流速为2.2 L/min;流动相为乙腈与水的混合液(体积比为65∶35);柱温30 ℃,流速1.0 mL/min。

1.3 数据处理

相关实验均设置三个平行实验,数据分析借助Origin 8.0软件处理完成;采用SAS软件进行ANOVA分析。

2 结果与讨论

2.1 不同来源果糖基水解酶的生物信息特征比较

虽然黑曲霉CBS 513.88的基因组信息(EMBL AM270980～AM270998)已经被解析[13],但是其果糖基水解酶系的具体功能及性质的差异还没有确定。为了研究这些酶的结构、功能及其潜在的应用价值,利用BLAST等软件从NCBI中共查到5个来源于黑曲霉的果糖基水解酶基因,分别命名为fru1、fru2、fru3、fru4和fru5。它们编码的酶分子AngFru1、AngFru4和AngFru5分别具有蔗糖酶、内切菊粉酶和外切菊粉酶活性,而AngFru2和AngFru3具有假定的蔗糖酶活性。

2.1.1 不同来源果糖基水解酶的亲缘关系分析 利用软件MEGA 4.0将5个黑曲霉来源的果糖基水解酶与已报道的果糖基水解酶的氨基酸序列进行系统进化树的构建,其结果如图1所示。由图1可知,这些果糖基水解酶可以分为五类:内切菊粉酶、细菌蔗糖酶或菊粉酶、外切菊粉酶、酵母菌蔗糖酶或菊粉酶、丝状真菌蔗糖酶。其中,AngFru1、AngFru2和AngFru3属于丝状真菌蔗糖酶,而AngFru4和AngFru5分别属于内切菊粉酶和外切菊粉酶。

2.1.2 果糖基水解酶的氨基酸序列比对 氨基酸序列比对的结果表明,这些序列之间的相似度为10.27%～98.45%,平均值为27.65%。这些酶都具有果糖基水解酶的8个比较保守的结构域,包括A、B、B1、C、D、E、F和G(图2)[14]。其中结构域A、D和E中还包含3个高度保守的酸性氨基酸残基(图2中灰色标出的氨基酸残基),它们位于糖苷水解酶32(GH32)家族蛋白的活性位点[14]。

通过对不同来源的果糖基水解酶进行亲缘关系远近的分析以及氨基酸序列比对,发现A.nigerCBS 513.88来源的5个酶具有果糖基水解酶的高度保守的结构域。因此,它们均属于果糖基水解酶家族。

2.2 重组表达载体的构建

进一步制备黑曲霉CICIM F0510的cDNA,以此为模板,对上述5个目标基因进行PCR扩增,并成功克隆入pPIC9K的SnaB I和EcoR I位点,获得重组质粒。每个重组质粒的双酶切结果见图3。含fru1的重组质粒酶切出1.9 kb和9.3 kb两条带,与基因fru1和质粒pPIC9K的大小之和一致;其它四个质粒的酶切验证结果也是正确的。这表明五个重组质粒构建成功,并将它们分别命名为pPIC9K-fru1、pPIC9K-fru2、pPIC9K-fru3、pPIC9K-fru4和pPIC9K-fru5。

表2 黑曲霉果糖基水解酶的基本特征Table 2 Properties of fructosyl hydrolases from A. niger

图2 不同来源的果糖基水解酶的氨基酸序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of fructosyl hydrolases from different microorganisms注:(*),保守的氨基酸;(:),保守的替换;(.),半保守的替换;虚线表示的是空格。保守的酸性氨基酸残基用灰色标出,8个保守的结构域(A,B,B1,C,D,E,F和G)在上方标出。

图3 重组质粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmids by double enzyme digestion注:M:1kb DNA ladder;1:fru1;2:fru2;3:fru3;4:fru4;5:fru5。

通过测序结果可知,除了有少数碱基和氨基酸的差异,fru2、fru4和fru5的测序结果与原始序列基本一致;而fru1和fru3的测序结果与原始序列完全一致(表2)。

2.3 重组果糖基水解酶的诱导表达

将上述构建获得的5个重组质粒线性化后,转化毕赤酵母GS115,获得重组菌GS115(pPIC9K-fru1)、GS115(pPIC9K-fru2)、GS115(pPIC9K-fru3)、GS115(pPIC9K-fru4)和GS115(pPIC9K-fru5)。采用含有50 mL培养基的摇瓶进行发酵实验,在甲醇的诱导下进行酶液制备。发酵持续120 h,离心收集获得重组果糖基水解酶Fru1、Fru2、Fru3、Fru4和Fru5的粗酶液。通过酶活测定发现,重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/mL(表3),远远高于目前报道的菊粉酶[15]和蔗糖酶[12,16]的酶活,具有潜在的工业化前景;Fru2表达水平很低,检测不到酶活,与文献报道一致[2];而Fru3和Fru4的酶活几乎检测不到,后续会将这三个基因在其它表达系统中进行表达。同步以pPIC9K质粒转化毕赤酵母GS115获得含有空白质粒的重组菌,其发酵液检测不到果糖基水解酶酶活。

表3 重组果糖基水解酶的酶活Table 3 Activity of recombinant fructosyl hydrolases

注:“-”表示未检测到酶活。

2.4 重组果糖基酶的酶学特征的研究

2.4.1 酶的最适反应温度和热稳定性 进一步对重组酶Fru1和Fru5的酶学性质进行研究。在不同温度下测定Fru1和Fru5的酶活,结果见图4(a)。重组酶Fru1的最适反应温度为45 ℃,低于黑曲霉TH-2来源的蔗糖酶的最适反应温度(65 ℃)[12];而重组酶Fru5的最适作用温度为50 ℃,高于细菌来源菊粉酶的最适反应温度(30～37 ℃),但低于链霉菌及青霉菌菊粉酶的最适反应温度(60～70 ℃)[8]。温度过高或过低,酶活均会迅速下降,温度的变化对二种酶活都有较大的影响。热稳定性的研究表明,重组酶Fru1和Fru5分别在30～45 ℃和40～55 ℃内较稳定(残留的酶活在80%以上);而且在50～65 ℃内,Fru5的热稳定性优于Fru1(图4b)。此外,残留酶活小于40%的温度范围分别为55 ℃以上和65 ℃以上。

图4 Fru1和Fru5的最适作用温度和热稳定性 Fig.4 The optimal temperature and thermostability of Fru1 and Fru5注:a:最适作用温度;b:热稳定性。

2.4.2 酶的最适反应pH和pH稳定性 在不同pH反应条件下测定重组酶Fru1和Fru5的酶活,结果如图5(a)所示。重组酶Fru1与Fru5的最适作用pH分别为5.5和5.0,而且它们均具有相对宽泛的pH作用范围(pH4.5～6.0和pH4.0～5.5),在该pH范围内相对酶活在80%以上。Fru1的最适作用pH高于黑曲霉TH-2的蔗糖酶的最适反应pH(4.4)[12];而Fru5的最适反应pH与已报道的黑曲霉来源菊粉酶的最适反应pH(4.0～5.0)[8,15]接近,也与已报道的丝状真菌和酵母菌来源菊粉酶的最适pH(4.5～6.0)接近[8]。由pH稳定性的研究结果可知,在不同pH的0.1 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中孵育1 h后,重组酶Fru1和Fru5分别在pH3.0～7.0和pH5.0～6.5的偏酸性条件下稳定性较好,残留酶活在80%以上(图5b)。与Fru5和来源于黑曲霉TH-2的蔗糖酶[12]相比,Fru1在较宽泛的pH范围内相对酶活稳定。

图5 Fru1和Fru5的最适作用pH及pH稳定性 Fig.5 The optimum pH and pH stability of Fru1 and Fru5 注:a:最适作用pH;b:pH稳定性。

2.4.3 离子和金属螯合剂对酶的影响 各种金属离子和螯合剂对重组酶酶活的影响见表4。由表4可知,K+、Zn2+和Mg2+对重组酶Fru1的酶活有微弱的抑制作用,而Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+和Ca2+对其酶活有抑制作用,其中Ca2+的抑制作用比较显著;Li+和Na+对Fru5的酶促反应有促进作用,而且Na+的促进作用比较明显;Fe2+能显著地抑制其酶活,而Zn2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+和Co2+对其酶活有微弱的抑制作用。此外,EDTA对重组酶Fru1和Fru5的酶活均有微弱的促进作用,表明它们不是金属酶[8]。

表4 金属离子和螯合剂对Fru1和Fru5酶活的影响Table 4 Effects of metal ions and chelating agents on the activity of Fru1 and Fru5

图6 重组酶Fru1和Fru5作用于蔗糖的产物分析 Fig.6 HPLC profile of sucrose catalyzed by recombinant Fru1 and Fru5注:a:蔗糖空白对照;b:Fru1;c:Fru5;峰1、2、3分别代表蔗糖、葡萄糖和果糖;峰4、5为高聚合度物质。

注:“-”表示未进行酶活测定;*表示有显著性差异(p<0.05)。2.4.4 重组酶的底物催化特征分析 不同来源的蔗糖酶和菊粉酶与蔗糖和菊粉的结合及作用方式有差异,从而生成的产物也不同。为了考察重组酶Fru1和Fru5对蔗糖和菊粉作用产物聚合度的分布,对反应产物进行了HPLC分析。当以蔗糖为底物时,重组酶Fru1既可以将蔗糖水解为葡萄糖和果糖,也可以将其转化为高聚合度的产物(图6b)。因此,它既有水解作用,又有合成作用。而Fru5只能将蔗糖水解,并无合成作用(图6c)。后续可以利用重组酶Fru1和Fru5对蔗糖的水解作用制备果葡糖浆[8],而Fru1对蔗糖的合成作用在低聚果糖、低聚乳果糖等新型果糖基衍生品的制备过程中具有潜在的应用价值[4-5]。

由图7(a)可知,菊粉由13种物质混合组成。当以菊粉为底物时,重组酶Fru1能水解掉二糖、三糖、四糖和部分五糖,对六糖以上的多糖没有作用(图7b),它是否对菊粉有合成作用,还有待进一步分析。而Fru5能将不同聚合度的菊粉全部水解为单糖(图7c),因此它对菊粉只有水解作用,没有合成作用。因此,Fru5具有典型的外切菊粉酶的底物催化特征[17],可以用于高果糖浆及结晶果糖的生产过程中。此外,菊粉经过外切菊粉酶水解后产生的果糖可以作为发酵碳源,用于生产生物乙醇、生物油脂、乳酸、柠檬酸和单细胞蛋白等[8,18]。

图7 重组酶Fru1和Fru5作用于菊粉的产物分析 Fig.7 HPLC profile of inulin catalyzed by recombinant Fru1 and Fru5注:a:菊粉空白对照;b:Fru1;c:Fru5;峰1、2、3、4、5、6、7…12分别代表G(F)、GF(F2)、GF2(F3)、GF3(F4)、GF4(F5)、GF5(F6)、GF6(F7)…,其中,G和F分别为葡萄糖和果糖。

3 结论

本研究通过分子克隆与遗传重组技术克隆及表达了黑曲霉来源的全部果糖基转移酶,获得的重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/mL,远远高于目前已报道的蔗糖酶和菊粉酶的活性,为其大规模工业化生产奠定了良好的基础。此外,酶学性质的研究表明,重组酶Fru1对蔗糖具有水解和合成活性,这为其用于果葡糖浆、低聚果糖以及低聚乳果糖的生产提供了可能。Fru5对蔗糖和菊粉都具有明显的水解作用,为其在高果糖浆和结晶果糖的制造以及发酵碳源的制备等方面提供了重要的指导意义。

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Recombinant expression and biochemical characterization of fructosyl hydrolases fromAspergillusniger

DONG Zi-xing1,2,XIAO Hua2,WANG Jing-pei2,ZHANG Zhi-meng2,WANG Jun2,LU Fu-ping2,*

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Objective:Fructosyl hydrolase plays a significant role in the preparation of novel fructose derivatives. It is important to obtain an efficient fructosyl hydrolase with high activity.Methods:Five fructosyl hydrolase-encoding genes in theAspergillusnigergenome were selected and analyzed by MEGA 4.0,Clustal X2 and other softwares. Subsequently,these genes were successfully cloned and expressed inPichiapastorisfollowed by comprehensive investigation of their biochemical properties. Results:At the shake-flask fermentation level,the activities of recombinant Fru1 and Fru5 were determined to be 1360 and 1560 U/mL,respectively,which were much higher than those of the fructosyl hydrolases ever reported. The optimum temperature and pH of recombinant enzyme Fru1 were 45 ℃ and 5.5,respectively. Its enzymatic activity was slightly enhanced by EDTA and inhibited by Na+,Co2+,Cu2+and Ca2+. Interestingly,this enzyme showed both hydrolytic and transglycosylation activities toward sucrose,and hydrolyzed short-chain inulin with degree of polymerization of 2～5. The temperature and pH optima of recombinant Fru5 were 50 ℃ and 5.0,respectively. It was remarkably enhanced by Li+,Na+and EDTA,and strongly inhibited by Fe2+. Fru5 could also hydrolyze sucrose and almost all polysaccharides in inulin. Conclusions:Our results have paved the way for the industrial manufacturing of fructosyl hydrolases and their applications in the production of novel fructose derivatives.

fructosyl hydrolases;novel fructose derivatives;Aspergillusniger;recombinant expression;enzymatic properties

2016-10-11

董自星(1986-)，男，博士，助理研究员，研究方向：酶工程与技术，E-mail:dzx@tust.edu.cn。

*通讯作者:路福平(1967-)，男，博士，教授，研究方向：应用微生物与酶工程，E-mail:lfp@tust.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0178-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.026