高良姜粗多糖体外降胆固醇效果研究

廖坤梅，白天禾，陈楚华，钟晓婷，张 鹏，李泽清，谌素华

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

高良姜粗多糖体外降胆固醇效果研究

廖坤梅，白天禾，陈楚华，钟晓婷，张 鹏，李泽清，*谌素华

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

采用热水浸提法提取高良姜粗多糖，采用不同体积分数的乙醇沉淀高良姜粗多糖，并以高良姜粗多糖得率作为评价指标，确定粗多糖最佳醇沉体积分数，结果表明使用无水乙醇得到的高良姜粗多糖得率最高约为1.58%；采用体外模拟肠道超声波乳化法制备胆固醇胶束，按照胆固醇试剂盒法检测高良姜粗多糖结合胆固醇胶束能力，结果表明高良姜粗多糖对胆固醇胶束的结合率最高约为76.09%；使用紫外分光光度法测定高良姜粗多糖结合胆酸盐能力，结果表明其对牛磺胆酸钠的结合率约为70.18%，对水合胆酸钠的结合率约为79.55%，对甘氨胆酸钠的结合率约为83.04%。由此可见，高良姜粗多糖具有较好的体外降胆固醇效果。

高良姜；粗多糖；胆固醇胶束；胆酸盐

高良姜为姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根茎，别名风姜、小良姜、高凉姜、良姜等，为卫生部认定的药食同源物之一。高良姜营养成分丰富，含有丰富的糖类、蛋白质、微量元素等，现代药理学研究表明高良姜具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[1-2]。目前，国内外对高良姜的研究主要集中于黄酮、芳香油等化学成分，以及抑菌、抗肿瘤、降血脂等药理功能上[3]，对高良姜多糖的研究较少。关于春砂仁、莪术等其他姜科植物多糖的研究发现，多种姜科植物多糖都具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等作用。广东省湛江市徐闻县是“高良姜之乡”，高良姜种植总面积为4 690 hm2，居全国之首，产量占全国总产量的90%以上[4-7]。

近年来，随着我国人民生活水平的提高，人均胆固醇水平也有了显著增高，导致冠心病、脑血栓等一系列心脑血管疾病的增多，亟待寻找和开发天然高效的降胆固醇物质。高良姜多糖是一种具有极大开发潜力的活性物质，其体外结合胆固醇效果的研究目前尚未见报道。

试验采用热水浸提法提取高良姜粗多糖，并通过体外结合胆固醇胶束试验及结合胆酸盐试验，评价其体外降胆固醇效果，旨在为加大高良姜的开发利用提供一定科学依据，以便于高良姜粗多糖能尽快作为保健食品进入市场，帮助高胆固醇人群降低胆固醇水平。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高良姜：取自徐闻县，用蒸馏水洗净后去皮，切片，于60℃恒温箱中干燥4 h，质量恒定后粉碎。过60目筛，干燥保存待用。

无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、氯化钠、氢氧化钠等，均为分析纯，广东光华科技股份有限公司提供；油酸、L-α-卵磷脂，均为分析纯，Sigma-Aldrich公司提供；甘氨胆酸钠水合物、牛磺胆酸钠、水合胆酸钠，均为分析纯，Aladdin公司提供；胆固醇，为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供；胆固醇试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 仪器与设备

FD8508型真空冷冻干燥机，韩国Ilshin公司产品；Varioskan Flash型全自动酶标仪，Therom公司产品；HH S21-6型水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；JYL-C020E型料理机，杭州九阳股份有限公司产品；DD5M型低速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司产品；N-1000D-W型旋转蒸发器，上海爱朗仪器有限公司产品；DC12H型氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 高良姜粗多糖的提取

采用热水浸提法[8]：称取20 g高良姜粉，用860 mL蒸馏水溶解，于95℃条件下加热4 h，期间每隔20 min搅拌1次，使多糖尽量溶出。粗多糖提取液以转速4 600 r/min离心10 min，过滤去除姜粉残渣。将粗多糖溶液旋转蒸发浓缩后，在4℃冰箱中醇析12 h，再次离心，取其沉淀，并用无水乙醇洗涤3次并晾干。Sevage法脱蛋白6次，冷冻干燥48 h得到高良姜粗多糖粉末。

1.3.2 高良姜粗多糖提取的最适乙醇体积分数测定

分别取3份100 mL浓缩后的高良姜粗多糖提取液，分别加入60%，70%，80%，90%乙醇及无水乙醇100 mL，按1.3.1中的方法操作提取多糖，计算最终的高良姜粗多糖得率。

1.3.3 高良姜粗多糖总糖含量的测定

采用蒽酮比色法：称取0.01 g标准葡萄糖溶于100 mL蒸馏水中，配制成葡萄糖标准溶液。取7支具塞试管分别加入上述标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8 mL，并加蒸馏水补至1 mL。再于冰水浴中加入蒽酮试剂4 mL，管口加盖，沸水浴10 min。冰水浴冷却至室温，于波长620 nm处测其吸光度，并绘制标准曲线。

再取适量质量浓度的高良姜粗多糖溶液1 mL，以同样方法测定其吸光度，对照标准曲线计算出高良姜总糖含量。

1.3.4 高良姜粗多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法：称取0.01g葡萄糖溶解于100 mL蒸馏水中，取10支试管分别加入0，0.1～0.9 mL葡萄糖溶液并补充蒸馏水到1 mL，再加入6%苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL，冷却10 min后摇匀。在室温下放置20 min，于波长490 nm处测OD值。以葡萄糖质量浓度为横坐标、OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

再取适量质量浓度的高良姜粗多糖溶液1 mL按上述方法测量其OD值，并对照标准曲线计算出粗多糖含量。

1.3.5 高良姜粗多糖结合胆固醇胶束试验

胆固醇胶束溶液配制参考文献[9]，并稍作改动。称取0.058 g胆固醇（最终质量浓度0.5 mmol/L），0.267 g卵磷脂（最终质量浓度2.4 mmol/L），0.085 g油酸（最终质量浓度1.0 mmol/L）溶解于100 mL甲醇中，超声波处理5 min，输出功率84 W（70%），使其充分溶解。氮气吹干后加入19.8 mmol/L牛磺胆酸钠溶液、396 mmol/L氯化钠溶液、pH值7.4磷酸缓冲液各100 mL，然后超声波处理2次，每次4 min，输出功率108 W（90%）。处理后的溶液在37℃条件下培养12 h，以形成胆固醇胶束溶液。

取上述胆固醇胶束溶液，加入不同量的高良姜粗多糖溶液，在37℃恒温摇床上培养2 h，以转速10 000 r/min离心20 min。用胆固醇试剂盒测定胆固醇含量，即分别取每个样品2.5 μL滴于96孔板上，并取2.5 μL蒸馏水，2.5 μL校准液于孔板中，然后分别加入250 μL工作液，混匀，在37℃条件下孵育10 min，用酶标仪于波长510 nm处测定各孔板的吸光度。每个样品做3个重复。

1.3.6 高良姜粗多糖结合胆酸盐试验

试验参考文献[10]，并稍作改动。准确称取牛磺胆酸钠0.032 g（最终浓度0.3 mmol/L），甘氨胆酸钠0.029 g（最终浓度0.3 mmol/L），水合胆酸钠0.026 g（最终浓度0.3 mmol/L），分别溶于200 mL pH值7.6的磷酸缓冲液中，作为母液。

取上述母液0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL于10 mL具塞比色管中，加入pH值为7.6的磷酸缓冲液补至2 mL，再加入5 mL硫酸，于70℃条件下水浴20 min，取出后冰水浴5 min，用紫外分光光度计于波长387 nm处测量其吸光度。以胆酸盐质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，分别绘制3种胆酸盐的标准曲线。

分别取2，4，6，8，10 mL高良姜粗多糖溶液，加入蒸馏水补至10 mL，并分别加入2 mL模拟胃液（HCl浓度0.1 mol/L），在37℃恒温摇床中培养2 h，以0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.6。每份样品中加入胆酸盐母液4 mL，在37℃恒温摇床中培养2 h。将混合物转入离心管，以转速4 000 r/min离心20 min，取上清液按上述方法测定胆酸盐含量。每个样品做3个重复，1个底物空白，1个胆酸盐空白。对照胆酸盐标准曲线测定得出其胆酸盐含量。

2 结果与分析

2.1 醇析中乙醇体积分数对高良姜粗多糖得率的影响不同乙醇体积分数提取高良姜粗多糖结果见图1。

图1 不同乙醇体积分数提取高良姜粗多糖结果

由图1可知，在试验的条件下以60%，70%，80%，90%乙醇进行醇析，高良姜粗多糖得率分别为0.77%，0.93%，1.29%，1.46%；以无水乙醇进行醇析，高良姜粗多糖得率为1.58%。因此，确定以无水乙醇进行醇析为最佳方案。

2.2 高良姜粗多糖中总糖及多糖含量测定结果

总糖的标准曲线方程为：

Y=0.010 7X-0.013 9，R2=0.997 2；

多糖的标准曲线方程为：

Y=1.041 5X+0.003 4，R2=0.993 8。

对照标准曲线计算得高良姜粗多糖中总糖含量约为58.68%，多糖含量约为34.22%。

2.3 高良姜粗多糖结合胆固醇胶束能力测定

高良姜粗多糖胆固醇胶束结合率见图2。

由图2可知，随着高良姜粗多糖溶液体积的增加，与胆固醇胶束结合率呈上升趋势，并在加入10 mL高良姜粗多糖溶液（约含有7.5 mg高良姜多糖）后曲线趋于平缓，结合率最高约为76.09%。说明高良姜粗多糖能够有效地结合胆固醇，降低胆固醇质量浓度。

2.4 高良姜粗多糖结合胆酸盐试验

牛磺胆酸钠的标准曲线方程为：

Y=17.744X+0.025 8，R2=0.996 8，

水合胆酸钠的标准曲线方程为：

Y=12.252X+0.012 2，R2=0.996 4，

甘氨胆酸钠的标准曲线方程为：

Y=15.422X+0.028 3，R2=0.996 4.

高良姜粗多糖胆酸盐结合率见图3。

图2 高良姜粗多糖胆固醇胶束结合率

图3 高良姜粗多糖胆酸盐结合率

由图3可知，随着高良姜粗多糖溶液体积的增加，与3种胆酸盐的结合率均呈上升趋势。在加入8 mL高良姜粗多糖溶液（约含有6 mg高良姜多糖）后上升趋势减缓，在加入10 mL高良姜粗多糖溶液（约含有8 mg高良姜多糖）时基本达到最高的结合率，此时粗多糖对牛磺胆酸盐的结合率约为70.18%，对水合胆酸盐的结合率约为79.55%，对甘氨胆酸盐的结合率约为83.04%。可见，高良姜粗多糖有一定的结合胆酸盐能力。

3 结论

（1）采用热水浸提法提取高良姜粗多糖，采用不同体积分数的乙醇沉淀高良姜粗多糖，并以高良姜粗多糖得率作为评价指标，确定粗多糖最佳醇沉体积分数。结果表明，使用无水乙醇得到的高良姜粗多糖得率最高，约为1.58%。

（2）采用体外模拟肠道超声波乳化法制备胆固醇胶束，并用试剂盒测定其结合胆固醇胶束能力，在加入10 mL高良姜粗多糖溶液时，胆固醇结合率最高，约为76.09%，证明高良姜粗多糖有较好的体外结合胆固醇胶束能力。

（3）使用分光光度法测定其结合胆酸盐能力，结果表明在加入10 mL高良姜粗多糖时，对牛磺胆酸盐的结合率约为70.18%，对水合胆酸盐的结合率约为79.55%，对甘氨胆酸盐的结合率约为83.04%。可见，高良姜粗多糖有较好的体外结合胆酸盐效果。

[1]安宁，杨世林，邹忠梅，等.高良姜黄酮类化学成分的研究[J].中草药，2006（5）：663-664.

[2]李洪福，李永辉，王勇，等.高良姜化学成分及药理活性的研究[J].中国实验方剂学杂志，2014（7）：236-244.

[3]Zhang Beibei，Dai Yuan，Liao Zhixin，et al.Three newantibacterial active diarylheptanoids from Alpinia officinarum[J].Fitoterapia，2010，81（7）：948-952.

[4]刘华强.高良姜走势分析[J].中国现代中药，2011（12）：63.

[5]杨全，严寒静，庞玉新，等.南药高良姜药用植物资源调查研究[J].广东药学院学报，2012（4）：382-386.

[6]胡佳惠，闫明.高良姜的研究进展[J].时珍国医国药，2009（10）：2 544-2 546.

[7]吕玮，蒋伶活.高良姜的化学成分及药理作用[J].中国药业，2006（3）：19-21.

[8]郑义，王卫东，李勇，等.高良姜多糖提取工艺优化及其抗氧化活性[J].食品科学，2014（2）：126-131.

[9]Kirana C，Rogers P F，Bennett L E，et al.Naturally derived micelles for rapid in vitro screening of potential cholesterol-lowering bioactives[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005（5）：4 623-4 627.

[10]刘静娜.壳聚糖降脂作用机理研究[D].无锡：江南大学，2008.◇

Research on the Effect of Cholesterol Lowering in Vitro of Alpinia officinarum Hance Crude Polysaccharide

LIAO Kunmei，BAI Tianhe，CHEN Chuhua，ZHONG Xiaoting，ZHANG Peng，LI Zeqing，*CHEN Suhua
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

This article used the hot water extraction method to extract the crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance，and determined the best alcohol precipitation concentration by measuring crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance in different alcohol precipitation concentration.The result indicates that by using absolute alcohol，the experiment got the highest crude polysaccharide extraction rate（around 1.58%）.The article used simulated intestinal environment and ultrasonic emulsification method to preparation cholesterol micelle，and uses cholesterol reagent kit to determination the ability of cholesterol micelle combination.In the measuring range of this experience the highest cholesterol micelle combination is about 76.09%. The article also uses ultraviolet spectrophotometric method to determination the ability of bile salt combination.Result shows that the sodium taurocholate combination rate of Alpinia officinarum Hance crude polysaccharide is 70.18%，while the figure for hydration sodium cholate and sodium glycocholate is around 79.55%and 83.04%.It is demonstrate that the crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance has preferable ability of cholesterol lowering in vitro according to this experiment.

Alpinia officinarum Hance；crude polysaccharide；cholesterol micelle；cholate salt

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.029

1671-9646（2017）05b-0004-03

2017-04-25

大学生创新创业训练计划项目（CXXL2014025）。

廖坤梅（1990—），女，在读本科，研究方向为食品科学与工程。

*通讯作者：谌素华（1973—），女，硕士，高级实验师，研究方向为食品科学与工程专业教学与科研。