血清肝素结合表皮生长因子 mRNA水平与急性冠状动脉综合征的关系

韩鹏黎，程晓丹，刘建华，刘新叶，池豪，曹巍，杨东伟

血清肝素结合表皮生长因子 mRNA水平与急性冠状动脉综合征的关系

韩鹏黎，程晓丹，刘建华，刘新叶，池豪，曹巍，杨东伟

目的：探讨血清中肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）信使核糖核酸（mRNA）水平与急性冠状动脉（冠脉）综合征的关系。

方法：采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测50例急性冠脉综合征患者（ACS组）及100例正常对照组（NC组）血清中 HB-EGF mRNA的表达水平，运用Logistic回归分析评估其与急性冠脉综合征的关系。

结果：与NC组相比，ACS组患者的HB-EGF mRNA水平较高（0.22±0.73 vs 0.46±0.14，P＜0.05）。校正高血压、吸烟、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、体重指数等单因素分析中有意义的因素后，HB-EGF mRNA水平与急性冠脉综合征有关（比值比=5.813，95%可信区间：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA每增加0.1个灰度值，急性冠脉综合征风险增加4.813倍。

结论：血清中HB-EGF mRNA水平升高与急性冠脉综合征有关。

肝素结合表皮生长因子；RNA，信使；急性冠状动脉综合征

冠心病是一组因冠状动脉（冠脉）粥样硬化致使血管腔狭窄、阻塞或功能性改变如冠脉痉挛导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病变，是严重危害人类健康的常见病，其病理改变在本质上是动脉粥样硬化。近10年来我国居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趋势。农村上升更为明显[1]。动脉粥样硬化的发生是一个十分漫长的过程，是内皮细胞功能紊乱和炎性反应的结果，但目前动脉粥样硬化的发病机制尚未完全明确。急性冠脉综合征（ACS）是冠心病中较严重的类型，是以冠脉粥样硬化斑块破裂或糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，易发生心力衰竭以及猝死等严重并发症[2]。

近年来，国内外相关研究显示，肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）作为一种内皮细胞生长因子，具有广泛的生物学活性。HB-EGF可以促进平滑肌细胞有丝分裂、增殖及迁移，促进血管内膜增生以及血管重构[3]。有研究发现，冠心病患者血清HBEGF较高[4]；2010年刘红旗等[5]发现，在动脉粥样硬化斑块组织的平滑肌细胞和巨噬细胞中，HBEGF 表达显著增高。因此，HB-EGF可能促进动脉粥样硬化的发生和发展。本研究通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术分析ACS患者血清中HB-EGF 信使核糖核酸（mRNA）的表达情况，分析HB-EGF mRNA水平与ACS的关系，以期为ACS分子基因水平上的防治提供新思路和新途径。

1 资料与方法

一般资料：从郑州大学附属郑州中心医院2015～2016年的住院病例中选取入院诊断考虑ACS并通过冠脉造影（CAG）确诊的50例患者作为ACS组，以同期经冠脉造影排除冠心病诊断的100 例患者作为正常对照组（NC组）。所有入组病例均排除严重肝肾脑肺疾病、严重瓣膜性心脏病、心肌病、风湿性心脏病、肺原性心脏病、重症感染、甲状腺功能亢进症、活动性结核、近1个月内应用激素或免疫抑制剂、肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病或感染急性期、银屑病、妊娠、近期皮肤及组织损伤等疾病。

试剂：血液RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒、2×Taq MasterMix 逆转录试剂盒、100bp Ladder Marker 试剂盒（上述试剂均购自北京康为世纪生物公司）；PCR 引物及PCR反应体系mix由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

ACS诊断：ACS包括ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型ACS， ACS患者诊断参照中华医学会心血管病学分会2015年《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》[6,7]、2012年《非ST段抬高ACS诊断和治疗指南》[8]中的诊断标准。

基本指标的测量：身高及体重测量：要求选用同一身高体重计测量，所有能站立的对象均于入院后第一个清晨在空腹状态下，穿单衣单裤、赤脚，脚跟、骶骨部及两肩胛间紧靠身高计立柱上；不能站立者采用赛康985型电子病床透析秤测量患者体重，于患者能够站立时测量身高。所有数据均连续测两次取其平均值，计算体重指数（BMI）。

血脂测定：所有患者均于入院后第一个清晨空腹采取外周静脉血，测定其甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆胆固醇（LDL-C），所有标本使用德国罗氏全自动生化仪测定。

外周血提取 RNA：所有患者均采取外周动脉血（用柠檬酸盐、 乙二胺四乙酸或肝素等抗凝剂处理过的血液样品），所取标本按购买试剂盒说明书严格执行 RNA 提取，提取过程中保持无菌原则，取 1 μl RNA 经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。并予紫外分光光度计准确定量，要求 OD260/OD280 处于1.8～2.2 之间。

RNA 逆转录成 cDNA：提取 RNA 后立即行逆转录，按逆转录试剂盒说明书严格执行，所得逆转录产物保存于-20 ℃冰箱。

RT-PCR（表 1）：收集所有标本后进行 RT-PCR。PCR 总反应体系为20 μl，其中逆转录产物 2 μl、Mix 10 μl、各基因上下游引物分别 1 μl、无核糖核酸酶水6 μl。PCR 仪型号：德国 biometra T-Gradient。HB-EGF扩增条件：94℃预变性5 min（94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸30 s）循环34次，72℃延伸7 min，4℃保存；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）扩增条件：94℃预变性5 min（94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s）循环34次，72℃延伸7 min，4℃保存。

PCR 产物琼脂糖凝胶电泳及结果分析：配制1.5% 琼脂糖凝胶，取 PCR 目的基因产物及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）各 3 μl点样后进行电脉，设置恒压为 90 V，约 30 min 后结束电泳，用凝胶成像分析系统（型号：美国 alpha3400）观察结果，拍照后测定 DNA 扩增带光密度值，取目的基因光密度值与相应GAPDH光密度值之比作为统计参数。

统计学方法：应用 SPSS 20.0 软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，用Logistic回归分析法评估HB-EGF mRNA水平与ACS的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 逆转录-聚合酶链式反应引物设计与合成

2 结果

2.1 ACS组和NC组患者的临床资料比较（表2）

ACS 组和NC组患者的临床资料比较，除年龄、性别组成、糖尿病外，高血压、吸烟、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HB-EGF mRNA等指标在两组间的差异均有统计学意义。

表2 ACS组与NC组患者的临床资料（±s）

2.2 单因素Logistic回归分析结果（表3）

以是否罹患ACS为应变量（1=是，0=否），将HB-EGF mRNA×10、年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟、BMI、TC、TG、LDL-C、高血压等因素作为自变量（性别：1=男，0=女；高血压：1=是，2=否；糖尿病：1=是，2=否；吸烟：1=是，2=否），进行单因素Logistic回归分析，结果发现，HB-EGF mRNA水平与ACS有关[比值比（OR）=4.810，95%可信区间（CI）：3.080～7.514，P＜0.001]；PCR扩增条带也提示，ACS组患者的HB-EGF mRNA水平高于NC组（图1）。另外，单因素分析显示，高血压、吸烟、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均与ACS有关。

2.3 多因素Logistic回归分析结果

多因素回归分析校正了高血压、吸烟、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在单因素分析中有意义的指标，结果发现，HB-EGF mRNA×10仍然与是否罹患ACS有关（OR=5.813，95%CI：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA水平每增加0.1个灰度值，ACS风险增加4.813倍。

图1 ACS组和NC组患者血清HB-EGF信使核糖核酸的表达情况

表3 单因素Logistic回归分析结果

3 讨论

HB-EGF 是表皮生长因子家族成员之一，是多种类型细胞有丝分裂原，亦涉及许多生理和病理过程，包括心脏发育及心肌修复、心肌肥大、皮肤伤口愈合、眼睑形成、肾集合管生成、胚泡着床、肺动脉高压、肿瘤形成等。HB-EGF 在动脉粥样硬化、平滑肌细胞增生中有重要作用[9]。HB-EGF 与胞膜上表皮生长因子受体（EGFR）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）紧密结合，通过蛋白激酶 C 和 Ca2+等信号途径发挥作用，促进平滑肌细胞、上皮细胞、系膜细胞、纤维细胞等多种细胞增生[10]。

Matsumoto等[4]发现，在动脉粥样硬化斑块组织中，HB-EGF在血管平滑肌细胞和巨噬细胞的表达显著提高，促进动脉硬化，而在非动脉粥样硬化成人动脉中，内膜平滑肌细胞 HB-EGF呈均匀分布，且随着年龄的增加而缓慢增加。Reape等[11]在动脉粥样硬化斑块组织HB-EGF 的表达和定位的研究中发现，对比正常和动脉粥样硬化的血管壁，HB-EGF mRNA 只在动脉粥样硬化组织和用其培养的血管平滑肌细胞中表达，在巨噬细胞中高表达。两项关于动脉粥样硬化免疫组化的最新临床研究均发现，HB-EGF在斑块局部呈阳性表达，证实 HBEGF 能刺激平滑肌细胞细胞的增殖、迁移，从而在动脉粥样硬化形成的过程中发挥作用[12,13]。

本研究发现，血清中HB-EGF mRNA水平、高血压、吸烟、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均与ACS有关，由于本研究旨在分析HB-EGF mRNA水平与ACS的关系，因此进行多因素Logistic回归分析时校正了高血压、吸烟、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在单因素分析中有意义的指标，结果发现，HB-EGF mRNA水平仍然与ACS有关（OR=5.813，95%CI：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA每增加0.1个灰度值，ACS风险增加4.813倍。HB-EGF mRNA在ACS的发生和发展过程中可能作为一个独立危险因子存在。本文的研究结果与上述多项研究结果相符。

综上所述，血清中HB-EGF mRNA水平与ACS有关。

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Relationship Between Serum mRNA Level of Heparin Binding Epidermal Growth Factor and Acute Coronary Syndrome Occurrence

HAN Peng-li, CHENG Xiao-dan, LIU Jian-hua, LIU Xin-ye, CHI Hao, CAO Wei, YANG Dong-wei.
Center of Translational Medicine, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou (450007), Henan, China

YANG Dong-wei, Email: yangdongwei@126.com

Objective: To evaluate the relationship between serum mRNA level of heparin binding epidermal growth factor (HBEGF) and acute coronary syndrome (ACS) occurrence.

Methods: Our research included in 2 groups: ACS group, n=50 patients and Control group, n=100 normal subjects. Serum HB-EGF mRNA level was examined by RT-PCR and the relationship between HB-EGF mRNA and ACS occurrence was assessed by Logistic regression analysis.

Results: Compared with Control group, the serum HB-EGF mRNA level of ACS group was higher (0.22±0.73) vs (0.46±0.14), P＜0.05. With adjusted meaningful factors of hypertension, smoking, TG, TC, LDL-C, HDL-C and BMI by single factor analysis, multi Logistic regression analysis indicated that serum HB-EGF mRNA was related to ACS occurrence (OR=5.813, 95% CI 2.342-14.426, P＜0.001) which meant that upon 0.1 grey value of HB-EGF mRNA elevation, the risk of ACS occurrence may increase 4.813 folds accordingly.

Conclusion: Serum HB-EGF mRNA level was related to ACS occurrence.

Heparin binding epidermal growth factor; mRNA; Acute coronary syndrome (Chinese Circulation Journal, 2017,32:748.)

book=748,ebook=24

2016-12-04）

（编辑：朱柳媛）

河南省科技厅科技攻关项目（142102310460）

450007 河南省郑州市，郑州大学附属郑州中心医院 转化医学中心（韩鹏黎、曹巍），心血管内科（程晓丹、刘建华、刘新叶、池豪、杨东伟）

韩鹏黎 药师 硕士 主要研究方向为药理学 Email：hanpengli2013@163.com 通讯作者：杨东伟 Email：yangdongwei@126.com

R54

A

1000-3614（2017）08-0748-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.005