金黄色葡萄球菌定量检测中四种培养基的比较

□ 苏妙贞 曾晓琮 韩志杰 周 露 广东省食品检验所

金黄色葡萄球菌定量检测中四种培养基的比较

□ 苏妙贞 曾晓琮 韩志杰 周 露 广东省食品检验所

使用Baird-Parker平板、RPF平板、金黄色葡萄球菌显色培养基平板及3M PerifilmTM金黄色葡萄球菌测试片对金黄色葡萄球菌检测，浓度范围在103～104CFU/mL，3M测试片、金黄色葡萄球菌显色培养基、RPF平板与BP平板结果相当。在实际检测中，选择适当的培养基辅助检测，结果更加准确可靠。

金黄色葡萄球菌；定量检测；培养基

金黄色葡萄球菌是我国细菌性食物中毒的致病菌之一，致病力与产生肠毒素相关。而肠毒素的产生与样品中金黄色葡萄球菌浓度有关，一般认为浓度≥105CFU/g，即可能产生肠毒素[1]。因此国际食品微生物标准委员会（ICMSF）采样方案设定指南中，把金黄色葡萄球菌的危险性列为中度危害，偶尔会使人严重不适，治疗后无后遗症，病程较短，症状可治愈。中度危害菌采用三级采样方案，即允许一定量的金黄色葡萄球菌存在于样品中。GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》是根据风险监测和评估结果，参考CAC、ICMSF和澳大利亚、新西兰、香港、台湾等国际组织、国家和地区不同类别即食食品中金黄色葡萄球菌限量标准，按三级采样方案设置肉制品、水产制品、粮食制品、即食豆类制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品及即食调味品8类食品中金黄色葡萄球菌限量[2]。

金黄色葡萄球菌定量检测在日常微生物检验工作中所占比重越来越大，选出一个简便、快捷并准确的方法变得十分有必要。本文通过对四种培养基比较，得出它们优缺点，为提高检测效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

2015年食药总局组织的金黄色葡萄球菌盲样考核样品，共10份。样品为10个西林瓶装金黄色葡萄球菌菌球和10袋奶粉样品，每袋奶粉质量为25 g，每个相同编码金黄色葡萄球菌样品和奶粉样品作为1件样品检测，以平板计数法报告检测结果，单位为CFU/g。将奶粉与小球放入盛有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，均质1 min。

1.1.2 主要培养基

成品Baird-Parker琼脂平板（广东环凯微生物科技有限公司）；成品兔血浆纤维蛋白原琼脂平板（RPF平板，广东环凯微生物科技有限公司）；金黄色葡萄球菌显色培养基（法国科马嘉公司）；金黄色葡萄球菌测试片（美国3M公司）；金黄色葡萄球菌反应确认片（美国3M公司）；冻干血浆（广东环凯微生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的检验

Baird-Parker平板、 RPF平板、金黄色葡萄球菌显色培养基平板均依据GB 4789.10-2010 第二法 平板计数法检验涂布法涂布，三块平板即吸取2～3个稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液以0.3、0.3、0.4 mL接种量分别加在三块平板上，涂布均匀、培养[3]。3M金黄色葡萄球菌测试片按说明书测试，即吸取1 mL样品匀液，揭起上层膜，将样品滴加在测试片中央处，使用压板将样品均匀覆盖于培养面积上，等样品吸收完毕后培养。

1.2.2 选择性鉴定实验

Baird-Parker平板依据 GB 4789. 10-2010《第二法鉴定可疑菌落》，即革兰氏染色及血浆凝固酶实验。RPF平板血浆凝固酶阳性菌落为灰黑色菌落，外围是一个浑浊沉淀环。科马嘉的金黄色葡萄球菌显色平板根据说明书判断，一般金黄色葡萄球菌为紫红色菌落。3M金黄色葡萄球菌测试片上的金黄色葡萄球菌一般为紫红色，如有黑色菌落则需使用反应确认片确定，即掀开测试片上层膜，将确认片置入小心压紧，不能残留气泡，36 ℃继续培养1～3 h后观察结果，金黄色葡萄球菌会在菌落周围出现粉红色环。

2 结果与分析

2.1 培养基选择性比较

选择性比较结果见表1。

10份样品中，在BP平板上生长的菌落均为黑色，区分金黄色葡萄球菌主要看浑浊带及透明圈的大小。当平板上菌落数较少时，很容易从板上分辨出金葡菌，但菌落数达到100个左右时，由于采用涂布法，菌分布在培养基表面，不同菌落容易互相重叠，浑浊带与透明圈交叉，影响典型菌落的计数。显色平板和3M测试片的典型菌落均为紫红色，与非金葡菌区分开来。在RPF平板上生长的菌落也是黑色的，血浆凝固酶阳性的菌落会在外围形成浑浊带，用于区分金黄色葡萄球菌。RPF平板与BP平板相似，同样存在平板上菌落较多时浑浊带互相影响导致计数不准确。四种培养基检出金黄色葡萄球菌的数量见表2。

2.2 测试结果

使用SPSS软件分析以上结果，BP平板的测试结果与显色平板（P=0.747＞0.05）、3M纸片（P=0.826＞0.05）、RPF平板（P=0.909＞0.05）无显著性差异。

3 结论

从此次考核样品结果来看，金黄色葡萄球菌的浓度范围在103～104，这个范围落在了GB 29921-2013设定金黄色葡萄球菌最高安全限量值M内，具有日常检验的参考意义。在此浓度范围内，使用BP平板、显色平板和RPF平板作涂布法检测结果与3M纸片法结果相当，无显著差异。由于涂布法使用涂布棒会带走一部分菌体，所以理论上直接加样的3M纸片结果会比涂布法高。要降低涂布带来的菌体损失，使用疏水材质的一次性涂布棒。

对比几种培养基，3M金黄色葡萄球菌测试片操作方便，能够缩短检测时间，易于观察。但样品出现黑色菌落时，需要附加使用反应确认片确认，菌量较多时粉红色晕圈的重叠现象会影响观察，此时需要加大稀释度。显色平板同样具有缩短检测时间，结果容易观察，可采用倾注法和涂布法实验。显色培养基不需要高压灭菌，直接加热溶解即可，能减少工作量。金黄色葡萄球菌在科马嘉显色培养基上为粉红色菌落，杂菌一般为蓝绿色菌落及白色菌落，易于区分，无需实验。RPF培养基与BP培养基类似，以氯化锂和亚碲酸钾抑制非葡萄球菌生长，但RPF培养基添加牛纤维蛋白原和兔血浆，能使血浆凝固酶阳性葡萄球菌形成灰黑色菌落，周围有乳白色沉淀环，直观区分血浆凝固酶阳性菌落，不需如BP培养基可疑的菌落，纯培养做血浆凝固酶实验，大大节省时间。不过RPF培养基也存在当菌落数较大时沉淀环互相重叠影响观察的问题，需要通过多做稀释度控制平板上菌落数量。

表1 选择性比较结果

表2 四种培养基检出金黄色葡萄球菌的数量

虽然3M测试片、显色培养基和RPF培养基对比BP培养基均具有一定优势，但成本高于BP培养基。BP培养基在检测实验室中通常只需购买基础，再用鸡蛋与亚碲酸钾加入即可配好，其他三种培养基则需要直接购买成品，不利于控制成本，而且不是GB 4789.10-2010中指定的培养基，不能用于此方法数据的出具。但在使用BP培养基进行检测的同时，可以附加几种培养基实验，既可缩短检测时间，保证检测结果的准确性。

[1]刘海卿,佘之蕴,陈丹玲,等.金黄色葡萄球菌三种定量检验方法的比较[J].食品研究与开发,2014,35(13):113-115.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 29921-2013 食品安全国家标准 食品中致病菌限量[S].北京:中国标准出版社,2014.

[3]中华人民共和国卫生部.GB 4789.10-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[S].北京:中国标准出版社,2010.