潺槁树根皮化学成分及其抗糖尿病靶点筛选研究△

吴悠楠，董琳，李祎莹，谭银丰，金燕，李友宾*，张小坡*

(1.海南医学院 药学院，海南 海口 571199；2.海南医学院 基础医学与生命科学学院，海南 海口 571199)

潺槁树根皮化学成分及其抗糖尿病靶点筛选研究△

吴悠楠1，董琳1，李祎莹2，谭银丰1，金燕1，李友宾1*，张小坡1*

(1.海南医学院 药学院，海南 海口 571199；2.海南医学院 基础医学与生命科学学院，海南 海口 571199)

目的：对潺槁树根皮化学成分进行研究，并探索化合物降糖作用靶点。方法：采用硅胶、Sephadex LH-20等柱色谱以及半制备HPLC进行分离，选择14个与糖代谢相关靶点蛋白，采用分子对接技术探索化合物降糖作用的靶点。结果：从潺槁树根皮中得到6个化合物，经波谱学方法鉴定为N-反式-阿魏酰酪胺(1)、N-顺式-阿魏酰酪胺(2)、N-反式-芥子酰酪胺(3)、锡兰肉桂醇(4)、波尔定碱(5)、新木姜子碱(6)。分子对接结果表明，化合物5、6与蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)结合度最高。结论：化合物1～4为首次从该属植物分离得到，化合物5、6可能通过调控PTP1B发挥功效。

潺槁树根皮；化学成分；降糖靶点

潺槁树Litseaglutinosa系樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea)植物，主产于海南、广西、广东等我国岭南地区。潺槁树作为民间药物，具有清热解毒的功效[1]。现代药理研究表明，潺槁树根皮提取物具有抗糖尿病作用[2]。化学成分研究表明，该植物中含有生物碱、木脂素、黄酮类成分[3-4]。为探索潺槁树根皮中抗糖尿病的活性成分，本论文对潺槁树根皮的化学成分进行研究，从中得到6个化合物，分别鉴定为：N-反式-阿魏酰酪胺(1)、N-顺式-阿魏酰酪胺(2)、N-反式-芥子酰酪胺(3)、锡兰肉桂醇(4)、波尔定碱(5)、新木姜子碱(6)。化合物1～4首次从该属植物中分离得到。已有文献报道波尔定碱、新木姜子碱具有降血糖作用[5-6]，但未见其作用靶点的报道。本研究通过采用分子对接技术，将两个化合物分别与14个与糖代谢相关的靶点进行分子对接。结果表明，两个化合物与蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)对接打分最高，提示波尔定碱、新木姜子碱可能通过调控PTP1B发挥功效。

1 仪器与材料

BRUKERAVⅢ600型核磁共振仪；超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；薄层色谱预制板(青岛海洋化工厂)；柱色谱硅胶(100～200目，200～300目，青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(Healthcare 公司)；LC-10AD二元低压半制备液相色谱仪；Agilent半制备色谱柱(Phenyl，25.0 cm×2.5 mm，5μm)；普通试剂均为分析纯(广州化学试剂厂)；氘代试剂(中国科学院武汉波谱公司)。分子对接采用Discovery Studio 4.5软件(BIOVIA公司)。

所用药材于2016年5月采自海南省文昌市铜鼓岭，经海南医学院曾念开教授鉴定为樟科木姜子属植物潺槁树Litseaglutinosa的根皮。

2 提取与分离

潺槁树根皮(7.0 kg)粉碎后，用70%乙醇水回流提取，提取3次，每次2 h。减压回收溶剂，至无乙醇味。加水适量，石油醚(5 L)萃取3次，除去脂溶性成分，继而用正丁醇(5 L)萃取3次，减压浓缩后得到正丁醇萃取物(80 g)。正丁醇萃取物进行硅胶柱色谱分离，采用二氯甲烷-甲醇(1∶0，85∶15，80∶20，50∶50)梯度洗脱，经合并后得到流分Fr.A～Fr.H。Fr.A采用硅胶柱色谱分离，流动相为二氯甲烷-丙酮(9∶1)，再进行凝胶柱色谱，流动相为甲醇，最后经反相高效液相制备色谱分离，流动相为甲醇-水(65∶35)，得到化合物1(8.0 mg)、2(12.5 mg)、3(10.0 mg)。Fr.B采用硅胶柱色谱分离，流动相为二氯甲烷-丙酮(85∶15)，再进行凝胶柱色谱，流动相为甲醇，最后经反相高效液相制备色谱分离，流动相为甲醇-水(55∶45)，得到化合物4(8.6 mg)、5(535.5 mg)、6(628.0 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，碘化铋钾反应阳性，ESIm/z314.2 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.26 (1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.10 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，6.96 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.93 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6′)，6.75 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.65 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.38 (1H，J=15.6 Hz，H-8′)，3.78 (3H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：165.7 (C-9′)，156.0 (C-4)，148.8 (C-4′)，148.3 (C-3′)，139.3 (C-7′)，129.8 (C-2，6)，129.5 (C-1)，121.9 (C-6′)，119.4 (C-8′)，116.0 (C-5′)，111.2 (C-2′)，115.6 (C-3，5)，57.0 (-OCH3)，41.0 (C-8)，34.4 (C-7)。以上数据与文献报道的一致[7]，故化合物1鉴定为N-反式-阿魏酰酪胺，为首次从该属植物分离得到。

化合物2：白色粉末，碘化铋钾反应阳性，ESIm/z314.4 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.05 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，6.94 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.93 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6′)，6.68 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.63 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.45 (1H，d，J=11.2 Hz，H-7′)，5.70 (1H，J=11.2 Hz，H-8′)，3.78 (3H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：166.6 (C-9′)，156.0 (C-4)，147.8 (C-4′)，147.3 (C-3′)，137.3 (C-7′)，129.9 (C-2，6)，128.6 (C-1)，126.7 (C-6′)，121.5 (C-8′)，115.2 (C-5′)，114.2 (C-2′)，115.6 (C-3，5)，57.0 (-OCH3)，41.0 (C-8)，34.3 (C-7)。以上数据与文献报道的一致[8]，故化合物2鉴定为N-顺式-阿魏酰酪胺，为首次从该属植物分离得到。

化合物3：白色粉末，碘化铋钾反应阳性，ESIm/z328.5 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.27 (1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，6.98 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.80 (2H，s，H-2′，6′)，6.65 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.42 (1H，J=15.6 Hz，H-8′)，3.75 (6H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)。以上数据与文献报道的一致[9]，故化合物3鉴定为N-反式-芥子酰酪胺，为首次从该属植物分离得到。

化合物4：白色晶体，mp 138～140 ℃，ESIm/z407.1 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：0.85，0.90，0.92 (各3H，J=6.6 Hz，19，20，15-CH3)，0.75 (3H，s，16-CH3)，1.18 (3H，s，17-CH3)，3.67 (1H，dd，J=9.6，3.6 Hz，H-1)，1.68 (1H，d，J=15.6 Hz，H-14a)，2.28 (1H，d，J=15.6 Hz，H-14b)，1.61 (1H，d，J=13.2 Hz，H-10a)，1.72 (1H，d，J=13.2 Hz，H-10b)，1.80 (1H，m，H-18)，1.95 (1H，m，H-2)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：71.2 (C-1)，32.8 (C-2)，28.7 (C-3)，26.6 (C-4)，84.1 (C-5)，86.1 (C-6)，97.3 (C-7)，88.9 (C-8)，49.6 (C-9)，43.3 (C-10)，101.2 (C-11)，65.0 (C-12)，81.2 (C-13)，49.4 (C-14)，18.5 (C-15)，11.6 (C-16)，9.8 (C-17)，34.2 (C-18)，18.9 (C-19)，19.3 (C-20)。以上数据与文献报道一致[10]，故化合物4鉴定为锡兰肉桂醇，为首次从该属植物分离得到。

化合物5：无定形粉末，碘化铋钾阳性，ESIm/z360.2 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.84 (1H，s，H-11)，6.70 (1H，s，H-8)，6.48 (1H，s，H-3)，3.77 (3H，s，10-OCH3)，3.56 (3H，s，1-OCH3)，2.92 (1H，m，H-7a)，2.88 (1H，m，H-4b)，2.86 (1H，m，H-5a)，2.75 (1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-6a)，2.38 (3H，s，N-CH3)，2.28 (1H，m，H-5b)，2.22 (1H，m，H-7b)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：149.5 (C-2)，146.5 (C-10)，146.3 (C-9)，143.0 (C-1)，130.1 (C-7a)，129.2 (C-3a)，126.6 (C-1a)，125.9 (C-1b)，123.2 (C-11a)，115.7 (C-8)，114.7 (C-3)，112.4 (C-11)，62.7 (C-6a)，53.3 (C-5)，59.7 (1-OCH3)，56.2 (10-OCH3)，44.2 (N-CH3)，34.2 (C-7)，29.0 (C-4)。以上数据与文献报道一致[11]，故化合物5鉴定为波尔定碱。

化合物6：结晶性粉末，碘化铋钾阳性，mp 189～191 ℃，ESIm/z346.0 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.86 (1H，s，H-11)，6.72 (1H，s，H-8)，6.54 (1H，s，H-3)，3.78 (1H，dd，J=13.2，3.6 Hz，H-6a)，3.80 (3H，s，10-OCH3)，3.60 (3H，s，1-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：153.4 (C-2)，149.8 (C-9)，148.8 (C-1)，146.3 (C-10)，128.8 (C-7a)，128.6 (C-3a)，128.4 (C-1b)，124.8 (C-1a)，122.1 (C-11a)，117.0 (C-8)，116.2 (C-11)，113.9 (C-3)，64.6 (C-6a)，61.2 (1-OCH3)，56.8 (10-OCH3)，42.6 (C-5)，34.9 (C-7)，28.8 (C-4)。以上数据与文献报道一致[12]，故化合物6鉴定为新木姜子碱。

4 靶点的准备与对接

查询国内外的文献报道选取与糖代谢相关的关键靶点作为研究对象，分别有14个靶点，包括：过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα，IK71)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ，IK74)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K，1E7V)、蛋白激酶 A(PKA，3L9L)、蛋白激酶B(AKT，4EKL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，2AZ5)、胰岛素受体底物1(IRS1，IK3A)、胰岛素受体底物2(IRS2，3BU5)、磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMPKα，3AQV)、有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK，4QNY)、促分裂原活化蛋白激酶2(MEK2，1TVO)、促分裂原活化蛋白激酶2(MEK2，1S9I)、细胞外调节蛋白激酶1(ERK1，2ZOQ)、抑癌基因(LKB1，2WTK)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B，2QBQ)，括号内代表化合物的英文名称和PDB号。从蛋白质PDB结构数据库下载得到14个靶点的三维晶体结构并保存为PDB格式。利用Discovery Studio(4.5)软件Flexible Docking模块对靶点蛋白进行结构处理，具体操作是提取配体去除水分子及其他配体为蛋白质加氢并进行能量优化选择，其余参数均为默认设置。将每个化合物分别与14个靶点按默认参数进行分子对接。

5 分子对接结果

Flexible Docking模块先对蛋白活性口袋的侧链产生多个构象，然后将配体对接到受体的活性口袋当中，最后对得到的配体-受体复合物结构进行优化。Flexible Docking最大的优势在于准确，可以精细地研究配体-受体的相互作用信息。通过将波尔定碱、新木姜子碱与14个靶点对接，结果发现这两个化合物与PTP1B蛋白结合较好，提示这些成分的功效可能与调控PTP1B密切相关。波尔定碱与PTP1B对接示意图见图1。

图1 波尔定碱与PTP1B蛋白结合示意图

6 讨论

本论文报道了从潺槁树根皮中分离得到6个化合物，其中4个为首次从该属植物分离得到。另外，文献报道波尔定碱、新木姜子碱具有抗糖尿病作用，然而它们的作用靶点并不清楚。通过采用分子对接的方法，首次发现这两个化合物与PTP1B对接程度最高。波尔定碱、新木姜子碱的抗糖尿病作用极可能与调控PTP1B相关。

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ChemicalConstituentsfromBarkofLitseaglutinosaandTheirAntidiabeticTargets

WU Younan1，DONGLin1，LIYiying2，TANYinfeng1，JINYan1，LIYoubin1*，ZHANGXiaopo1*

(1.SchoolofPharmaceuticalScience，HainanMedicalUniversity，Haikou，571199，China；2.SchoolofBasicandLifeSciences，HainanMedicalUniversity，Haikou，571199，China)

Objective：To study the chemical constituents from the bark ofLitseaglutinosaand to investigate their antidiabetic targetsinsilico.Methods：Silica gel and Sephedex LH-20 column chromatographies as well as semi-preparative HPLC were applied to isolate and purify the compounds.Molecular docking was used to evaluate the binding activities of the ligands and the 14 selected proteins.Results：Six compounds were obtained and identified asN-trans-feruloyltyramine (1)，N-cis-feruloyltyramine (2)，N-trans-sinapoyltyramine (3)，cinnzeylanol (4)，boldine (5)，laurolitsine (6).Molecular docking results showed that compounds5and6banded well with PTP1B.Conclusion：Compounds1-4were isolated from genusL.glutinosafor the first time.Compounds5and6may exert their biological activities through regulating PTP1B.

Bark ofLitseaglutinosa；chemical constituents；targets of hypoglycemia

国家自然科学基金(81202994)

] 李友宾，研究员，研究方向：南药黎药的开发，E-mail：liyoubinli@sohu.com；张小坡，教授，研究方向：南药黎药的开发，E-mail：z_xp1412@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.010

2016-11-14)

*[