酸枣仁中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析△

张秋红，于姗姗，李磊

(1.济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102；2.济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102；3.济南市第四人民医院，山东 济南 250000)

酸枣仁中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析△

张秋红1*，于姗姗2，李磊3

(1.济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102；2.济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102；3.济南市第四人民医院，山东 济南 250000)

目的：比较不同产地及生炒酸枣仁的蛋白质电泳结果，分析它们之间的共性和差异。方法：本实验采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的技术对40个不同酸枣仁样品进行分析评价。结果：根据电泳指纹图谱整理分析的数据得到对酸枣仁的初步聚类分析结果。结论：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以大致定性区别不同产地的酸枣仁样品。

酸枣仁；蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳；聚类分析

2015版《中华人民共和国药典》收载酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子。酸枣仁味甘、酸，性平。归肝、胆、心经。用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴[1]。酸枣仁为养心安神药，生活中常被用作镇静、安眠、益肝类药品和相关保健食品的原料之一[2-3]。酸枣仁主产于山东、河北、陕西、辽宁、河南等地，内蒙古、甘肃、山西、安徽等地亦产，山东酸枣资源十分丰富，是我国酸枣仁的主要产区之一，素有“东枣仁”之称，产量大、质量优，主要产于蒙阴、平邑、沂水、青州、临朐、莱芜、历城、淄博、牟平等县(市)[4]。酸枣仁中包含的化学成分有：脂肪酸、皂苷、黄酮类化合物、生物碱、氨基酸等其他成分[5-7]，《中华人民共和国药典》将酸枣仁皂苷A和斯皮诺素两个化学成分作为指标性成分来监测酸枣仁质量[8]。

酸枣仁营养成分中脂肪占24.10%，蛋白质占0.80%，碳水化合物占61.00%，蛋白质是酸枣仁的主要成分之一。蛋白质作为基因的直接稳定产物，能反映生物DNA组成上的差异。种子蛋白是植物体中有高强度基因表达的一类，且能在种子内积累大量而不降解的蛋白质，其电泳谱带具有高度稳定性、专一性和叠加性。种子蛋白作为遗传标记常被用于品种鉴定及植物繁育系统的鉴别[9-10]。而聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)有机械性能好、化学性质稳定、几乎无渗电作用、样品重复性高、样品不易扩散、用量少、分辨率高、孔径可调节等优点，PACE应用范围广可用于蛋白质、酶、核酸等物质的分离[11]。本实验利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对山东省内、省外和一些进口的酸枣仁及其伪品的蛋白质进行了分析，以便为酸枣仁的质量控制研究提供辅助方法[12-16]。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

FA2004型电子天平；超声清洗机(南京先欧仪器制造有限公司)；SK-1型快速混匀旋涡机(中国深圳国华仪器厂 )；LGR16-W 型高速冷冻离心机(北京医用离心机厂)；BCD-215T BDZ型冰箱(青岛海尔)；微量进样器；KE0053471型移液器(10～100 μL)；移液器(100～1000 μL)；普通注射器；DYCZ-24A 型电泳仪槽(北京六一仪器厂)；DYY-8B型稳流稳压电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(BioSens SC 805)；酸度计。

1.2 材料

样品由济南市食品药品检验中心张秋红老师提供，真品鉴定为酸枣ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，实验样品的产地、处理方法、采收时间等信息见表1。

表1 酸枣仁样品信息

1.3 试剂

丙烯酰胺(Amresco0341-500G)；双丙烯酰胺(Amresco 0172)；过硫酸铵；蔗糖(分析纯，天津市励特吉尔环保技术研究所，批号：2001.7.10)；Tris(三羟甲基氨基甲烷，分析纯，北京益利精细化学品有限公司，批号：940302)；甘氨酸；琼脂粉；TEMED(即四甲基乙二胺，上海展云化工有限公司，批号：1204055)；溴酚蓝；冰醋酸；考马斯亮蓝(R250)；甲醇。分离胶缓冲液(pH 8.9)，分离胶贮存液，0.56%过硫酸铵溶液，浓缩胶缓冲液(pH 6.7)，浓缩胶贮存液，40%蔗糖溶液，电极缓冲液(pH 8.3)，4%琼脂液，脱色液均需按常规方法配制。所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品与试剂的制备

2.1.1 试剂的制备

2.1.1.1 分离胶缓冲液 精密称取Tris 36.6 g调节pH至8.9，定容至100 mL。

2.1.1.2 分离胶贮液 精密称取丙烯酰胺28 g和双丙烯酰胺0.74 g，定容至100 mL。

2.1.1.3 0.56%过硫酸铵 精密称取过硫酸铵0.28 g，定容至50 mL。

2.1.1.4 浓缩胶缓冲液 精密称取Tris 2.99 g调节pH至6.7，定容至50 mL。

2.1.1.5 浓缩胶贮液 精密称取丙烯酰胺5 g和双丙烯酰胺1.25 g，定容至50 mL。

2.1.1.6 40%蔗糖溶液 精密称取蔗糖40 g，定容至100 mL。

2.1.1.7 电极缓冲液(pH 8.3) 精密称取Tris 0.6 g、甘氨酸2.88 g，加纯净水1000 mL备用。

2.1.1.8 考马斯亮蓝(R250)染色液 精密称取考马斯亮蓝(R250)1 g，加少量甲醇溶解，用含20%甲醇和7%醋酸的水溶液稀释至1000 mL。

2.1.1.9 脱色液 甲醇100 mL、冰醋酸35 mL，加纯净水至500 mL。

2.1.2 样品的制备 精密称定酸枣仁细粉各0.500 0 g，分别加入1 mL提取液(稀释至5倍的浓缩胶缓冲液pH 8.9)，研磨成匀浆状，冰浴超声提取15 min，冷冻离心，取清液，与等体积40%蔗糖溶液混合，作为供试品溶液，置冰箱内冷藏。

2.2 电泳槽安装与凝胶制备

将安装好的两块电泳槽下方，注入琼脂封底。按比例配置分离胶液80 mL，超声脱气10 min后加入TEMED 150 μL，混匀，立即缓缓注入已安装好的两块凝胶模中，用胶头滴管均匀地滴数滴纯净水于胶液上表面。待分离胶凝固，形成胶与水层之间的清晰的界面，用滤纸吸净多余水分。取按比例配置浓缩胶胶液20 mL，超声脱气混匀10 min后加入TEMED 50 μL，注入两块凝胶模子中。分别插上样品槽模板，待浓缩胶变为乳白色，垂直取出样品槽模板。凝胶的配制参见表2。

表2 蛋白质电泳凝胶的配制

2.3 上样与电泳

用微量进样器吸取样品提取液10 μL，缓缓注入浓缩胶样品槽内，其中0～20号样品为第一组，21～40号样品为第二组，采用平行条件点于两块凝胶电泳板。在负极槽电极缓冲液以溴酚蓝指示剂示踪，电泳开始时稳流40 mA，待溴酚蓝指示剂到达两胶交界处时即样品进入分离胶后，稳流50 mA。待指示剂行至分离胶与浓缩胶界线以下9 cm时，关闭电源，停止电泳。电泳过程为防止温度过高，整个过程应在冰箱内低温下进行。

2.4 染色与脱色

打开电泳槽，取出凝胶板后，切去琼脂与浓缩胶，保留分离胶，并标记前沿。随即将凝胶浸于考马斯亮蓝染色液中，室温下染色1 h，取出，倾去染色液，用蒸馏水洗去凝胶表面附着的染料，脱色液漂洗数次，直至谱带背景清晰。将凝胶板保存于7%醋酸溶液中。

3 结果与分析

3.1 结果

将脱去底色的电泳凝胶照相得到酸枣仁的蛋白质电泳图谱，结果见图1；经BioSens软件分析，蛋白质条带在各凝胶指纹图谱中的分布结果见图2。

图1 酸枣仁样品蛋白质电泳图谱

3.2 分析

根据电泳结果计算出每个品种各谱带的Rf值，用0、1表示电泳谱带的有无，在相同值位置上有蛋白质谱带的记为1，无带记为0，结果见表3。采用NTSYSpc 2.10e统计分析软件进行聚类分析，获得聚类分析图，见图3[17-19]。

图2 酸枣仁蛋白质电泳(Pro-PAGE)指纹图谱

表3 酸枣仁样品蛋白条带的Rf值

图3 酸枣仁蛋白质电泳图谱聚类图

4 讨论与结论

酸枣仁的蛋白质电泳指纹图谱出现较为明显的峰带15种，各个样品共有峰说明酸枣仁种内蛋白质种类的一致性，其他峰的有无和峰形明显不同，则体现了酸枣仁样品之间的差异性。

由酸枣仁聚类分析图可以看出，所有样品的相似性系数为0.53，真品酸枣仁与伪品兵豆(豆科兵豆属)染色之后外形相似，两者均是离瓣花亚纲植物种子，容易混淆，部分不法药商在酸枣仁中混入伪品兵豆以假乱真，不仅影响酸枣仁药效，还扰乱了药材市场秩序。聚类分析得出酸枣仁与兵豆的差异系数是0.47，所以蛋白质电泳可以初步鉴定酸枣仁真伪；中国产地的酸枣仁样品相似性系数是0.578；山东除了7个地区酸枣仁外，剩余大部分地区(77%)酸枣仁之间的相似性系数为0.64；山东泰安、莱芜的酸枣仁与河北、山西、河南等部分省外酸枣仁共性较大，相似性系数达到0.665，可能与品种引进种植或者土壤性质有关系；山东酸枣仁与中国其他地区产的酸枣仁差异程度为0.422；进口酸枣仁间的相似程度较高，达到0.76，且其蛋白谱带颜色最浅，指纹图谱峰形最少，明显区别于国产酸枣仁，也说明进口酸枣仁蛋白种类及含量均低于国产酸枣仁。一些同产地酸枣仁炒制之后与原有生品出现差异，一些蛋白质峰带消失，说明酸枣仁炒制处理可能会破坏部分蛋白质，若想尽可能保护利用酸枣仁蛋白质，则不宜作炒制处理，尽量使用生品。酸枣仁染色之后与原生品产生差异，所以染色也可能会影响酸枣仁蛋白质的稳定保存。17号是从市场购入，产地未知，根据以上酸枣仁聚类分析图结果，可以推断其可能是山东产地的酸枣仁[20-21]。

根据蛋白质电泳图谱中谱带颜色的深浅可以粗略判断酸枣仁中蛋白质含量多少，酸枣仁炒制或者染色处理之后，它们的蛋白图谱颜色与原来相比变浅，可见其蛋白含量减少了；从产地看，进口酸枣仁电泳图谱颜色明显比国产酸枣仁的浅，说明国产酸枣仁质量一般优于进口酸枣仁。

蛋白质是植物基因表达的产物，不同的品种具有不同的蛋白质谱带模式，用Pro-PAGE电泳指纹图谱可以有效地鉴别植物的品种。种子蛋白稳定且具有丰富的遗传多样性，可为许多中药材品种的分析提供辅助依据。

本实验药材提取方法简单，使用凝胶板较小的DYCZ-24D型电泳槽得到的蛋白质谱带不清晰，换用凝胶板较大DYCZ-24A型电泳槽之后蛋白质谱带分离较好。另外酸枣仁是种子类药材，含有很多的油脂成分会干扰种子蛋白质的提取，对蛋白电泳实验产生不利影响。已有文献对瓜蒌种子蛋白6种提取方法作出比较：蛋白质提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量较高，但杂质多，电泳谱带严重展宽而且明显拖尾；Tris-丙酮法提取的蛋白质种类缺失严重；直接提取法提取蛋白含量少，但杂质少，电泳谱带清晰，离心2次谱带更加清晰；所以水溶液直接提取法最适合用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，而蛋白质提取液提取法提出蛋白质含量最高[22]，故本实验采用最简单的水溶液直接提取法。实验结果表明本实验方法可定性分析酸枣仁蛋白质、粗略判断蛋白质含量以区别不同产地酸枣仁，但其准确度不高，有待找出更为准确的实验方法。

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AnalysisofProteininSemenZiziphiSpinosaebyPolyacryamideGelElectophoresis

ZHANG Qiuhong1，YUShanshan2*，LILei3

(1.JinanCenterforFoodandDrugControl，Jinan250102，China；2.JinanCenterforFoodandDrugControl，Jinan250102，China3.TheFourthPeople′sHospitalofJinanCity，Jinan250000，China)

Objective：To compare the protein of different kinds of Semen Ziziphi Spinosae by PAGE，and analyze their common ground and differentiation.Methods：Polyacryamide gel eletrophoresis was employed to analyze and evaluate 40 specimens of Semen Ziziphi Spinosae.Results：The elementary hierarchical cluster analysis results were obtained on the basis of pro-PAGE.Conclusion：Pro-PAGE can be used to rough qualitative distinguishing of Semen Ziziphi Spinosae specimens from different habitats.

Semen Ziziphi Spinosae；Pro-PAGE；hierarchical cluster analysis

山东省中医药管理局山东省中医药科学技术研究项目(2011-241)

] 张秋红 硕士，副主任中药师，研究方向：中药质量控制与资源研究；E-mail：Zhangqh9886@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.013

2017-01-13)

*[